Nuclear factor E2-related factor (Nrf2)는 전사인자로써, 정상 상태에서는 Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)에 의해 억제되어 있지만, 활성산소와 친전자성 물질 같은 다양한 자극인자에 의해 유도된 Keap1 단백질의 구조 변화는 Nrf2의 유리 및 핵 내 축적을 일으킨다. 그 후, antioxidant response ...
Nuclear factor E2-related factor (Nrf2)는 전사인자로써, 정상 상태에서는 Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)에 의해 억제되어 있지만, 활성산소와 친전자성 물질 같은 다양한 자극인자에 의해 유도된 Keap1 단백질의 구조 변화는 Nrf2의 유리 및 핵 내 축적을 일으킨다. 그 후, antioxidant response element (ARE)에 결합함으로써 다양한 범위의 항산화 유전자들의 발현을 조절한다. 본 연구에서는 인간의 대장암 세포주에서 간섭 RNA를 통한 Keap1 억제가 Nrf2로 조절되는 유전자들의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 사람의 대장선암종 세포주인 HT29, HCT116에 lentivirus 시스템을 이용하여 Keap1 shRNA를 영구 도입하여 Keap1 발현이 억제된 세포주를 확립하였다. 실험결과로서 Keap1이 억제된 HT29 및 HCT116에서 대조군 세포주보다 Nrf2 전사 활성이 1.5배 정도 증가되었고, 핵 내의 Nrf2 단백질 수준도 증가하였음을 확인하였다. 또한 Keap1 억제가 GPX2 (glutathione peroxidase 2), MT2A (metallothionein 2A), AKR1C1 (aldo-keto reductase 1C1), NQO1 (NAD(P)H: quinone oxidoreducase-1), GCLC (catalytic subunit of ?^-glutamyl cysteins licase), TXNRD (thioeredoxin reductase)를 포함한 많은 Nrf2 하위 항산화 유전자들의 mRNA 발현을 증가시켰다. 그 중, GCLC 유전자의 발현 증가에 따른 세포 내 총 GSH 양이 Keap1이 억제된 세포주에서 유의적으로 더 높음을 확인하였다. 증가한 Nrf2 하위 유전자 발현 결과, Keap1억제 대장암 세포주는 H2O2와 menadione으로 인한 산화적 스트레스에 높은 내성을 나타냄을 확인하였다. 그러나 doxorubicin, docetaxel 과 같은 항암제 처리에서는 감수성 면에서 차이를 관찰하지 못했다. 이러한 결과는 유전적인 Keap1 억제가 Nrf2를 통한 항산화 효과를 증가시킴으로써 세포 보호능을 증가시키는 방법으로 사용될 수 있음을 시사한다
Nuclear factor E2-related factor (Nrf2)는 전사인자로써, 정상 상태에서는 Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)에 의해 억제되어 있지만, 활성산소와 친전자성 물질 같은 다양한 자극인자에 의해 유도된 Keap1 단백질의 구조 변화는 Nrf2의 유리 및 핵 내 축적을 일으킨다. 그 후, antioxidant response element (ARE)에 결합함으로써 다양한 범위의 항산화 유전자들의 발현을 조절한다. 본 연구에서는 인간의 대장암 세포주에서 간섭 RNA를 통한 Keap1 억제가 Nrf2로 조절되는 유전자들의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 사람의 대장선암종 세포주인 HT29, HCT116에 lentivirus 시스템을 이용하여 Keap1 shRNA를 영구 도입하여 Keap1 발현이 억제된 세포주를 확립하였다. 실험결과로서 Keap1이 억제된 HT29 및 HCT116에서 대조군 세포주보다 Nrf2 전사 활성이 1.5배 정도 증가되었고, 핵 내의 Nrf2 단백질 수준도 증가하였음을 확인하였다. 또한 Keap1 억제가 GPX2 (glutathione peroxidase 2), MT2A (metallothionein 2A), AKR1C1 (aldo-keto reductase 1C1), NQO1 (NAD(P)H: quinone oxidoreducase-1), GCLC (catalytic subunit of ?^-glutamyl cysteins licase), TXNRD (thioeredoxin reductase)를 포함한 많은 Nrf2 하위 항산화 유전자들의 mRNA 발현을 증가시켰다. 그 중, GCLC 유전자의 발현 증가에 따른 세포 내 총 GSH 양이 Keap1이 억제된 세포주에서 유의적으로 더 높음을 확인하였다. 증가한 Nrf2 하위 유전자 발현 결과, Keap1억제 대장암 세포주는 H2O2와 menadione으로 인한 산화적 스트레스에 높은 내성을 나타냄을 확인하였다. 그러나 doxorubicin, docetaxel 과 같은 항암제 처리에서는 감수성 면에서 차이를 관찰하지 못했다. 이러한 결과는 유전적인 Keap1 억제가 Nrf2를 통한 항산화 효과를 증가시킴으로써 세포 보호능을 증가시키는 방법으로 사용될 수 있음을 시사한다
Nuclear factor E2-related factor (Nrf2) is the transcription factor that regulates arrays of antioxidant genes through the antioxidant response element (ARE) activation. In normal cell condition, Nrf2 is inhibited by Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), while various stimuli like reactive ox...
Nuclear factor E2-related factor (Nrf2) is the transcription factor that regulates arrays of antioxidant genes through the antioxidant response element (ARE) activation. In normal cell condition, Nrf2 is inhibited by Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), while various stimuli like reactive oxygen species and electrophiles can lead to conformational changes in the Keap1 protein, which in turn results in Nrf2 liberation and accumulation in the nucleus. In the current study, we aimed to investigate effects of Keap1 inhibition on Nrf2 regulated gene expression in human colon cancer cells. We established Keap1 knockdown stable cell lines using lentiviral shRNA gene delivery and subsequent puromycin (1 ??g/ml) selection for 4 weeks: shKeap1-HT29, shKeap1-HCT116 and each scramble RNA control cells (scHT29 and scHCT116) were obtained. When Nrf2 transcription activities were measured using reporter analysis, ARE luciferase activities in shKeap1-HT29 and shKeap1-HCT116 were about 1.5-fold higher than the scramble control cells. In addition, we could confirm elevated Nrf2 levels in immunoblot analysis of nuclear Nrf2 proteins Inhibition of Keap1 expression showed increased mRNA levels for many antioxidant genes, including glutathione peroxidase 2 (GPX2), metallothionein 2A (MT2A), aldo-keto reductase 1C1(AKR1C1), NAD(P)H; quinine-oxidoreductase-1 (NQO1), ?^-glutamate cysteine ligase catalytic subunit (GCLC), and thioredoxin reductase (TXNRD). In according to enhanced GCLC transcript expression, total glutathione (GSH) content was also increased in Keap1 knockdown cell lines. The Keap1 knockdown cells lines were more resistant to oxidative stress induced by H2O2 and menadione. However, sensitivity to anticancer drugs like doxorubicin and docetaxel was not affected by Keap1 inhibition. Taken together, these results indicate that Keap1 knockdown system can enhance the antioxidant capacity of human colon cancer cells by elevating the expression of antioxidant genes.
Nuclear factor E2-related factor (Nrf2) is the transcription factor that regulates arrays of antioxidant genes through the antioxidant response element (ARE) activation. In normal cell condition, Nrf2 is inhibited by Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), while various stimuli like reactive oxygen species and electrophiles can lead to conformational changes in the Keap1 protein, which in turn results in Nrf2 liberation and accumulation in the nucleus. In the current study, we aimed to investigate effects of Keap1 inhibition on Nrf2 regulated gene expression in human colon cancer cells. We established Keap1 knockdown stable cell lines using lentiviral shRNA gene delivery and subsequent puromycin (1 ??g/ml) selection for 4 weeks: shKeap1-HT29, shKeap1-HCT116 and each scramble RNA control cells (scHT29 and scHCT116) were obtained. When Nrf2 transcription activities were measured using reporter analysis, ARE luciferase activities in shKeap1-HT29 and shKeap1-HCT116 were about 1.5-fold higher than the scramble control cells. In addition, we could confirm elevated Nrf2 levels in immunoblot analysis of nuclear Nrf2 proteins Inhibition of Keap1 expression showed increased mRNA levels for many antioxidant genes, including glutathione peroxidase 2 (GPX2), metallothionein 2A (MT2A), aldo-keto reductase 1C1(AKR1C1), NAD(P)H; quinine-oxidoreductase-1 (NQO1), ?^-glutamate cysteine ligase catalytic subunit (GCLC), and thioredoxin reductase (TXNRD). In according to enhanced GCLC transcript expression, total glutathione (GSH) content was also increased in Keap1 knockdown cell lines. The Keap1 knockdown cells lines were more resistant to oxidative stress induced by H2O2 and menadione. However, sensitivity to anticancer drugs like doxorubicin and docetaxel was not affected by Keap1 inhibition. Taken together, these results indicate that Keap1 knockdown system can enhance the antioxidant capacity of human colon cancer cells by elevating the expression of antioxidant genes.
주제어
#human colon cancer cells (HT29 Nrf2 Keap1-Knockdown system Nrf2-regulated genes HCT116)
학위논문 정보
저자
정경아
학위수여기관
영남대학교 대학원
학위구분
국내석사
학과
약학 약물학
지도교수
곽미경
발행연도
2011
키워드
human colon cancer cells (HT29 Nrf2 Keap1-Knockdown system Nrf2-regulated genes HCT116)
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