OCT4/SOX2 및 NF-kBp65가 인간 Nanog 유전자의 전사조절에 미치는 영향분석 Analysis on the effects of OCT4/SOX2 and NF-kBp65 on the transcriptional regulation of the human Nanog gene원문보기
ES (Embryonic stem) cell의 다능성과 자가재생을 유지시켜주기 위해서는 OCT4, SOX2, NANOG와 같은 여러 줄기세포 특이적 인자들이 작용한다. Mouse ES cell에서 OCT4와 SOX2는 Nanog promoter에 결합하여 Nanog 유전자의 발현을 촉진한다는 사실이 알려져 있다. 본 연구에서는 Human Nanog promoter를 정밀 분석하기 위해 ES cell의 model로서 EC (Embryonic carcinoma) cell을 사용하였고 연속적인 deletion mutation을 가진 promoter-reporter construct를 제조하였다. Promoter의 최대 활성은 0.6 kb (—253/+365) promoter-reporter construct에서 발견되었으며, 이 construct에는 OCT4 및 SOX2의 binding site가 포함된다. OCT4와 SOX2의 기여도를 확인하기 위하여 OCT4 및 SOX2의 binding site에 site-directed mutation을 유도하고 promoter 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, OCT4나 SOX2 binding site 중 어느 한 군데라도 mutation이 존재하면 promoter 활성이 현저히 저해되었다. 또한 chromatin immunoprecipitation(ChIP)을 통하여 OCT4나 SOX2 protein이 Nanog promoter에 직접 결합하는 것을 확인하였다. 본 연구 결과를 통해 Human Nanog 유전자 발현에 있어 OCT4 및 SOX2가 필수적임을 직접적으로 확인할 수 있었다. 또한 최근 mouse의 ES cell에서 NANOG protein이 NF-κB protein과 상호작용하여 ...
ES (Embryonic stem) cell의 다능성과 자가재생을 유지시켜주기 위해서는 OCT4, SOX2, NANOG와 같은 여러 줄기세포 특이적 인자들이 작용한다. Mouse ES cell에서 OCT4와 SOX2는 Nanog promoter에 결합하여 Nanog 유전자의 발현을 촉진한다는 사실이 알려져 있다. 본 연구에서는 Human Nanog promoter를 정밀 분석하기 위해 ES cell의 model로서 EC (Embryonic carcinoma) cell을 사용하였고 연속적인 deletion mutation을 가진 promoter-reporter construct를 제조하였다. Promoter의 최대 활성은 0.6 kb (—253/+365) promoter-reporter construct에서 발견되었으며, 이 construct에는 OCT4 및 SOX2의 binding site가 포함된다. OCT4와 SOX2의 기여도를 확인하기 위하여 OCT4 및 SOX2의 binding site에 site-directed mutation을 유도하고 promoter 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, OCT4나 SOX2 binding site 중 어느 한 군데라도 mutation이 존재하면 promoter 활성이 현저히 저해되었다. 또한 chromatin immunoprecipitation(ChIP)을 통하여 OCT4나 SOX2 protein이 Nanog promoter에 직접 결합하는 것을 확인하였다. 본 연구 결과를 통해 Human Nanog 유전자 발현에 있어 OCT4 및 SOX2가 필수적임을 직접적으로 확인할 수 있었다. 또한 최근 mouse의 ES cell에서 NANOG protein이 NF-κB protein과 상호작용하여 NF-κB를 억제하며, ES cell의 분화가 진행되면 NF-κB가 증가한다는 것이 보고되었다. 본 연구에서는 분화가 진행되면서 증가하는 NF-κB protein이 NANOG protein의 발현을 조절 할 가능성을 확인하고자 하였다. 즉, Nanog promoter에서 NF-κBp65 protein binding site를 예측하였으며, 연속적인 결손 mutation을 통하여 Nanog promoter 0.8 kb (—448/+365)와 1.0 kb (—651/+365) 사이의 서열에 음성적인 조절부위를 발견하였다. 이 부분에서 NF-κBp65 protein binding site가 예측이 되었지만, site-directed mutagenesis를 통하여 음성적 조절부위에서 NF-κBp65 binding site는 중요하지 않음을 확인하였다. 또한 EC cell의 분화가 진행되면 NF-κBp65 protein이 증가하지만, ChIP assay 결과에 의하면 NF-κBp65가 Nanog promoter에 결합하지 않는 것을 확인하였다. NF-κB protein은 Nanog promoter에는 직접적으로 영향을 주지는 않지만, 분화에 있어서 중요한 인자이므로 분화와 관련된 mechanism을 규명하는 연구가 진행되어야 할 것이다.
ES (Embryonic stem) cell의 다능성과 자가재생을 유지시켜주기 위해서는 OCT4, SOX2, NANOG와 같은 여러 줄기세포 특이적 인자들이 작용한다. Mouse ES cell에서 OCT4와 SOX2는 Nanog promoter에 결합하여 Nanog 유전자의 발현을 촉진한다는 사실이 알려져 있다. 본 연구에서는 Human Nanog promoter를 정밀 분석하기 위해 ES cell의 model로서 EC (Embryonic carcinoma) cell을 사용하였고 연속적인 deletion mutation을 가진 promoter-reporter construct를 제조하였다. Promoter의 최대 활성은 0.6 kb (—253/+365) promoter-reporter construct에서 발견되었으며, 이 construct에는 OCT4 및 SOX2의 binding site가 포함된다. OCT4와 SOX2의 기여도를 확인하기 위하여 OCT4 및 SOX2의 binding site에 site-directed mutation을 유도하고 promoter 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, OCT4나 SOX2 binding site 중 어느 한 군데라도 mutation이 존재하면 promoter 활성이 현저히 저해되었다. 또한 chromatin immunoprecipitation(ChIP)을 통하여 OCT4나 SOX2 protein이 Nanog promoter에 직접 결합하는 것을 확인하였다. 본 연구 결과를 통해 Human Nanog 유전자 발현에 있어 OCT4 및 SOX2가 필수적임을 직접적으로 확인할 수 있었다. 또한 최근 mouse의 ES cell에서 NANOG protein이 NF-κB protein과 상호작용하여 NF-κB를 억제하며, ES cell의 분화가 진행되면 NF-κB가 증가한다는 것이 보고되었다. 본 연구에서는 분화가 진행되면서 증가하는 NF-κB protein이 NANOG protein의 발현을 조절 할 가능성을 확인하고자 하였다. 즉, Nanog promoter에서 NF-κBp65 protein binding site를 예측하였으며, 연속적인 결손 mutation을 통하여 Nanog promoter 0.8 kb (—448/+365)와 1.0 kb (—651/+365) 사이의 서열에 음성적인 조절부위를 발견하였다. 이 부분에서 NF-κBp65 protein binding site가 예측이 되었지만, site-directed mutagenesis를 통하여 음성적 조절부위에서 NF-κBp65 binding site는 중요하지 않음을 확인하였다. 또한 EC cell의 분화가 진행되면 NF-κBp65 protein이 증가하지만, ChIP assay 결과에 의하면 NF-κBp65가 Nanog promoter에 결합하지 않는 것을 확인하였다. NF-κB protein은 Nanog promoter에는 직접적으로 영향을 주지는 않지만, 분화에 있어서 중요한 인자이므로 분화와 관련된 mechanism을 규명하는 연구가 진행되어야 할 것이다.
Embryonic stem (ES) cells can self-renew maintaining the undifferentiated state. Self renewal requires many factors such as OCT4, SOX2, and NANOG. Reportedly OCT4 and SOX2 protein bind mouse Nanog promtoer and induce expression of NANOG protein in mouse ES cells. In this study, to understanded trans...
Embryonic stem (ES) cells can self-renew maintaining the undifferentiated state. Self renewal requires many factors such as OCT4, SOX2, and NANOG. Reportedly OCT4 and SOX2 protein bind mouse Nanog promtoer and induce expression of NANOG protein in mouse ES cells. In this study, to understanded transcriptional regulation of Nanog promoter, we used human embryonic carcinoma (EC) cells as a model system of ES cells and analyzed serially deletion mutant constructs and site-directed mutation of the human Nanog. The highest promoter activity was obtained in the 0.6 kb (—253/+365) promoter-reporter construct which includes the binding sites of OCT4 and SOX2. To further confirm contribution of OCT4 and SOX2 in Nanog gene expression, we introduced site- directed mutation(s) in the OCT4 and/or SOX2 binding sites of the human Nanog promoter 0.6 kb (—253/+365) and checked the influence of the mutation on the promoter activity using human EC cell line NCCIT. Mutation either in OCT4 binding site or SOX2 binding site significantly reduced the activity of Nanog promoter which directly confirmed that OCT4 and SOX2 binding is essential in human Nanog gene expression. NF-κB is a transcription factor involved in many biological activities. Expression and activity of NF-κBp65 increase upon differentiation of ES cells. Reportedly, NANOG protein directly binds to NF-κB protein and inhibits its activity in ES cells. Here, we found a potential binding site of NF-κBp65 in the human Nanog promoter and postulated that NF-κBp65 protein may regulate expression of the Nanog gene. We confirmed decrease of Nanog and increase of NF-κBp65 upon differentiation induced by retinoic acid in human EC cells. Although deletion analysis on the DNA fragment including NF-κBp65 binding site suggested involvement of NF-κBp65 in the negative regulation of the promoter, site-directed mutation of NF-κBp65 binding site had no effect on the Nanog promoter activity. Furthermore, no direct association of NF-κBp65 with the Nanog promoter was detected during differentiation. Therefore, we conclude that NF-κBp65 protein may not be involved in directly transcriptional regulation of Nanog gene expression in EC cells and possibly in ES cells. Although NF-κB is known to be involved in differentiation, the mechanism of action is still unclear and to be determined in the future.
Embryonic stem (ES) cells can self-renew maintaining the undifferentiated state. Self renewal requires many factors such as OCT4, SOX2, and NANOG. Reportedly OCT4 and SOX2 protein bind mouse Nanog promtoer and induce expression of NANOG protein in mouse ES cells. In this study, to understanded transcriptional regulation of Nanog promoter, we used human embryonic carcinoma (EC) cells as a model system of ES cells and analyzed serially deletion mutant constructs and site-directed mutation of the human Nanog. The highest promoter activity was obtained in the 0.6 kb (—253/+365) promoter-reporter construct which includes the binding sites of OCT4 and SOX2. To further confirm contribution of OCT4 and SOX2 in Nanog gene expression, we introduced site- directed mutation(s) in the OCT4 and/or SOX2 binding sites of the human Nanog promoter 0.6 kb (—253/+365) and checked the influence of the mutation on the promoter activity using human EC cell line NCCIT. Mutation either in OCT4 binding site or SOX2 binding site significantly reduced the activity of Nanog promoter which directly confirmed that OCT4 and SOX2 binding is essential in human Nanog gene expression. NF-κB is a transcription factor involved in many biological activities. Expression and activity of NF-κBp65 increase upon differentiation of ES cells. Reportedly, NANOG protein directly binds to NF-κB protein and inhibits its activity in ES cells. Here, we found a potential binding site of NF-κBp65 in the human Nanog promoter and postulated that NF-κBp65 protein may regulate expression of the Nanog gene. We confirmed decrease of Nanog and increase of NF-κBp65 upon differentiation induced by retinoic acid in human EC cells. Although deletion analysis on the DNA fragment including NF-κBp65 binding site suggested involvement of NF-κBp65 in the negative regulation of the promoter, site-directed mutation of NF-κBp65 binding site had no effect on the Nanog promoter activity. Furthermore, no direct association of NF-κBp65 with the Nanog promoter was detected during differentiation. Therefore, we conclude that NF-κBp65 protein may not be involved in directly transcriptional regulation of Nanog gene expression in EC cells and possibly in ES cells. Although NF-κB is known to be involved in differentiation, the mechanism of action is still unclear and to be determined in the future.
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