항생제의 발견 이후 박테리아 감염 환자들의 사망률은 기하급수적으로 감소되었다. 그러나 항생제의 남용은 항생제에 대한 다재내성 박테리아의 등장을 부추겼다. 그렇기 때문에 박테리아 내에서 항생제의 작용과 저항 기작을 연구하는 것은 이러한 문제의 해결책으로 매우 중요하다. 본 연구에서 본 연구자는 항생제의 타겟이 되는 16S rRNA의 G791 잔기와 항생제 저항 기작 중 하나인 multidrug efflux pump에 대해서 연구하였다. 선행연구를 통해서 대장균에서 16S rRNA에 위치하는 잔기 G791은 라이보좀이 기능 수행을 위해 중요한 잔기임을 발견했다. 단잭질 합성 기작에서 이 잔기의 기능적 역할을 알아보기 위해서 본 연구자는 791 잔기에 G에서 U로 변형이 일어난 돌연변이 라이보좀을 이용하여 multicopy suppressors를 찾아냈다. 발견된 relA는 라이보좀에 결합하며 stringent response를 유발하는 물질을 합성한다고 알려져 있다. 돌연변이 라이보좀에서 과발현된 RelA는 그렇지 않은 것과 비교하여 1.5배 이상의 ...
항생제의 발견 이후 박테리아 감염 환자들의 사망률은 기하급수적으로 감소되었다. 그러나 항생제의 남용은 항생제에 대한 다재내성 박테리아의 등장을 부추겼다. 그렇기 때문에 박테리아 내에서 항생제의 작용과 저항 기작을 연구하는 것은 이러한 문제의 해결책으로 매우 중요하다. 본 연구에서 본 연구자는 항생제의 타겟이 되는 16S rRNA의 G791 잔기와 항생제 저항 기작 중 하나인 multidrug efflux pump에 대해서 연구하였다. 선행연구를 통해서 대장균에서 16S rRNA에 위치하는 잔기 G791은 라이보좀이 기능 수행을 위해 중요한 잔기임을 발견했다. 단잭질 합성 기작에서 이 잔기의 기능적 역할을 알아보기 위해서 본 연구자는 791 잔기에 G에서 U로 변형이 일어난 돌연변이 라이보좀을 이용하여 multicopy suppressors를 찾아냈다. 발견된 relA는 라이보좀에 결합하며 stringent response를 유발하는 물질을 합성한다고 알려져 있다. 돌연변이 라이보좀에서 과발현된 RelA는 그렇지 않은 것과 비교하여 1.5배 이상의 chloramphenicol acetyltransferase (CAT) 단백질을 합성하였다. RelA 과발현에 의해 전체 라이보좀 풀에서 돌연변이 rRNA의 비율은 변하지 않았으며 CAT mRNA는 감소되었다. 이 결과는 multicopy suppressor로서 RelA의 형질이 플라스미드로부터 합성된 돌연변이 라이보좀과 CAT mRNA 로부터 유발된 것이 아님을 재확인해주었다. 본 연구자는 RelA의 형질이 세포 내에서 증가된 (p)ppGpp에 의해 유발되는 stringent response와 관련 있는지 알아보기 위하여 돌연변이 RelA를 선별하였다. 이렇게 선별된 돌연변이 RelA는 과발현할 때 정상 RelA와 마찬가지로 증가된 CAT 단백질을 합성하여야 하며, 아미노산 결핍 상태에서 stringent response를 일으킬 만큼의 충분한 (p)ppGpp를 합성하지 못하는 특성을 가져야 한다. 선별된 돌연변이 RelA 단백질은 정상의 RelA 단백질 보다 18.2 - 38.9%정도의 (p)ppGpp를 축적하였다. 이와 같은 결과는 돌연변이 라이보좀의 multicopy suppressor로서 RelA의 기능이 (p)ppGpp의 합성 능력으로부터 유발된 것이 아님을 나타낸다. 이와 같은 결론을 바탕으로 본 연구자는 stringent response와 관련된 RelA의 기능 이외에 알려지지 않은 기능인 U791 잔기를 소유한 돌연변이 라이보좀에 결합하여 저하된 돌연변이 라이보좀의 기능성을 회복한다는 사실을 발견하였다. 그람-음성 박테리아에서 발견되는 tripartite efflux pumps는 항생제 저항과 독성-단백질의 배출에 관련되어있다. 본 연구에서 본 연구자는 site-directed mutational analyses방법을 이용하여 막융합단백질인 AcrA의 ？\-hairpin tip 영역에 위치한 보존된 잔기가 tripartite efflux pump AcrAB-TolC의 작용에 필수적인 역할을 한다는 것을 밝혔다. 또한 생체 내에서의 기능 분석을 통하여 AcrA의 ？\-hairpin 길이와 아미노산 서열이 AcrAB-TolC pump의 기능을 형성하는데 유연성을 가지고 기능함을 밝혔다. 마지막으로 유전학적 상보성 실험을 통하여 AcrA의 ？\-hairpin tip 영역과 TolC의 aperture tip 영역 간의 기능적 상호관련성이 있음을 밝혔다. 본 연구자의 이러한 발견은 병원성 박테리아가 다양한 항생제에 대한 저항성을 갖는 것을 분자적인 수준에서 이해하는데 도움이 될 것이다.
항생제의 발견 이후 박테리아 감염 환자들의 사망률은 기하급수적으로 감소되었다. 그러나 항생제의 남용은 항생제에 대한 다재내성 박테리아의 등장을 부추겼다. 그렇기 때문에 박테리아 내에서 항생제의 작용과 저항 기작을 연구하는 것은 이러한 문제의 해결책으로 매우 중요하다. 본 연구에서 본 연구자는 항생제의 타겟이 되는 16S rRNA의 G791 잔기와 항생제 저항 기작 중 하나인 multidrug efflux pump에 대해서 연구하였다. 선행연구를 통해서 대장균에서 16S rRNA에 위치하는 잔기 G791은 라이보좀이 기능 수행을 위해 중요한 잔기임을 발견했다. 단잭질 합성 기작에서 이 잔기의 기능적 역할을 알아보기 위해서 본 연구자는 791 잔기에 G에서 U로 변형이 일어난 돌연변이 라이보좀을 이용하여 multicopy suppressors를 찾아냈다. 발견된 relA는 라이보좀에 결합하며 stringent response를 유발하는 물질을 합성한다고 알려져 있다. 돌연변이 라이보좀에서 과발현된 RelA는 그렇지 않은 것과 비교하여 1.5배 이상의 chloramphenicol acetyltransferase (CAT) 단백질을 합성하였다. RelA 과발현에 의해 전체 라이보좀 풀에서 돌연변이 rRNA의 비율은 변하지 않았으며 CAT mRNA는 감소되었다. 이 결과는 multicopy suppressor로서 RelA의 형질이 플라스미드로부터 합성된 돌연변이 라이보좀과 CAT mRNA 로부터 유발된 것이 아님을 재확인해주었다. 본 연구자는 RelA의 형질이 세포 내에서 증가된 (p)ppGpp에 의해 유발되는 stringent response와 관련 있는지 알아보기 위하여 돌연변이 RelA를 선별하였다. 이렇게 선별된 돌연변이 RelA는 과발현할 때 정상 RelA와 마찬가지로 증가된 CAT 단백질을 합성하여야 하며, 아미노산 결핍 상태에서 stringent response를 일으킬 만큼의 충분한 (p)ppGpp를 합성하지 못하는 특성을 가져야 한다. 선별된 돌연변이 RelA 단백질은 정상의 RelA 단백질 보다 18.2 - 38.9%정도의 (p)ppGpp를 축적하였다. 이와 같은 결과는 돌연변이 라이보좀의 multicopy suppressor로서 RelA의 기능이 (p)ppGpp의 합성 능력으로부터 유발된 것이 아님을 나타낸다. 이와 같은 결론을 바탕으로 본 연구자는 stringent response와 관련된 RelA의 기능 이외에 알려지지 않은 기능인 U791 잔기를 소유한 돌연변이 라이보좀에 결합하여 저하된 돌연변이 라이보좀의 기능성을 회복한다는 사실을 발견하였다. 그람-음성 박테리아에서 발견되는 tripartite efflux pumps는 항생제 저항과 독성-단백질의 배출에 관련되어있다. 본 연구에서 본 연구자는 site-directed mutational analyses방법을 이용하여 막융합단백질인 AcrA의 ？\-hairpin tip 영역에 위치한 보존된 잔기가 tripartite efflux pump AcrAB-TolC의 작용에 필수적인 역할을 한다는 것을 밝혔다. 또한 생체 내에서의 기능 분석을 통하여 AcrA의 ？\-hairpin 길이와 아미노산 서열이 AcrAB-TolC pump의 기능을 형성하는데 유연성을 가지고 기능함을 밝혔다. 마지막으로 유전학적 상보성 실험을 통하여 AcrA의 ？\-hairpin tip 영역과 TolC의 aperture tip 영역 간의 기능적 상호관련성이 있음을 밝혔다. 본 연구자의 이러한 발견은 병원성 박테리아가 다양한 항생제에 대한 저항성을 갖는 것을 분자적인 수준에서 이해하는데 도움이 될 것이다.
Since antibiotics had been discovered, the mortality of bacterial infection patients has been decreased. However, abuse of antibiotics has caused the appearance of super-resistant bacteria which is insensitive to various antibiotics. Therefore, studies of action and mechanisms of antibiotics resista...
Since antibiotics had been discovered, the mortality of bacterial infection patients has been decreased. However, abuse of antibiotics has caused the appearance of super-resistant bacteria which is insensitive to various antibiotics. Therefore, studies of action and mechanisms of antibiotics resistance are important to resolve these problems, human infectious diseases. In this study, I analyzed 16S rRNA residue G791 which is targeted by many kinds of antibiotics, and multidrug efflux pump AcrAB-TolC which is one of the major antibiotic resistance repertoire. In the previous studies, it was identified that G791 in Escherichia coli 16S rRNA is a crucial residue for ribosome function. In order to establish the functional role of this residue in protein synthesis, I searched for multicopy suppressors of the mutant ribosomes that bear a G-to-U substitution at position 791. I identified relA, a gene whose product has been known to interact with ribosomes and trigger the stringent response. Overexpression of RelA resulted in the synthesis of approximately 1.5 times more chloramphenicol acetyltransferase (CAT) proteins than could be synthesized by the mutant ribosomes in the absence of RelA overexpression. The ratio of mutant rRNA to the total ribosome pool was not changed, and the steady-state level of CAT mRNA was decreased by RelA overexpression. These data confirmed that the phenotype of RelA as a multicopy suppressor of the mutant ribosome did not result from the enhanced synthesis of mutant rRNA or CAT mRNA from the plasmid. To test whether the phenotype of RelA was related to the stringent response induced by the increased cellular level of (p)ppGpp, I screened for mutant RelA proteins. Overexpression of these mutant RelA proteins enhance CAT protein synthesis by the mutant ribosomes as effectively as wild-type RelA overexpression and then screened for those whose overexpression does not produce sufficiently high levels of (p)ppGpp to trigger the stringent response under the condition of amino acid starvation. Overexpression of the isolated mutant RelA proteins resulted in the accumulation of (p)ppGpp in cells, which was amounted to approximately 18.2 to 38.9% of the level of (p)ppGpp found in cells that overexpress the wild-type RelA. These findings suggest that the function of RelA as a multicopy suppressor of the mutant ribosome does not result from its (p)ppGpp synthetic activity. I conclude that RelA has a previously unrecognized role in ribosome function. Tripartite efflux pumps found in Gram-negative bacteria are involved in antibiotic resistance and toxic protein secretion. In this study, I show, using site-directed mutational analyses, that the conserved residues located in the tip region of the ？\-hairpin of the membrane fusion protein (MFP) AcrA play an essential role in the action of the tripartite efflux pump AcrAB-TolC. In addition, I provide in vivo functional data showing that both the length and the amino acid sequence of the ？\-hairpin of AcrA can be flexible for the formation of a functional AcrAB-TolC pump. Genetic-complementation experiments further indicated functional interrelationships between the AcrA hairpin tip region and the TolC aperture tip region. These findings may offer a molecular basis for understanding the multidrug resistance of pathogenic bacteria.
Since antibiotics had been discovered, the mortality of bacterial infection patients has been decreased. However, abuse of antibiotics has caused the appearance of super-resistant bacteria which is insensitive to various antibiotics. Therefore, studies of action and mechanisms of antibiotics resistance are important to resolve these problems, human infectious diseases. In this study, I analyzed 16S rRNA residue G791 which is targeted by many kinds of antibiotics, and multidrug efflux pump AcrAB-TolC which is one of the major antibiotic resistance repertoire. In the previous studies, it was identified that G791 in Escherichia coli 16S rRNA is a crucial residue for ribosome function. In order to establish the functional role of this residue in protein synthesis, I searched for multicopy suppressors of the mutant ribosomes that bear a G-to-U substitution at position 791. I identified relA, a gene whose product has been known to interact with ribosomes and trigger the stringent response. Overexpression of RelA resulted in the synthesis of approximately 1.5 times more chloramphenicol acetyltransferase (CAT) proteins than could be synthesized by the mutant ribosomes in the absence of RelA overexpression. The ratio of mutant rRNA to the total ribosome pool was not changed, and the steady-state level of CAT mRNA was decreased by RelA overexpression. These data confirmed that the phenotype of RelA as a multicopy suppressor of the mutant ribosome did not result from the enhanced synthesis of mutant rRNA or CAT mRNA from the plasmid. To test whether the phenotype of RelA was related to the stringent response induced by the increased cellular level of (p)ppGpp, I screened for mutant RelA proteins. Overexpression of these mutant RelA proteins enhance CAT protein synthesis by the mutant ribosomes as effectively as wild-type RelA overexpression and then screened for those whose overexpression does not produce sufficiently high levels of (p)ppGpp to trigger the stringent response under the condition of amino acid starvation. Overexpression of the isolated mutant RelA proteins resulted in the accumulation of (p)ppGpp in cells, which was amounted to approximately 18.2 to 38.9% of the level of (p)ppGpp found in cells that overexpress the wild-type RelA. These findings suggest that the function of RelA as a multicopy suppressor of the mutant ribosome does not result from its (p)ppGpp synthetic activity. I conclude that RelA has a previously unrecognized role in ribosome function. Tripartite efflux pumps found in Gram-negative bacteria are involved in antibiotic resistance and toxic protein secretion. In this study, I show, using site-directed mutational analyses, that the conserved residues located in the tip region of the ？\-hairpin of the membrane fusion protein (MFP) AcrA play an essential role in the action of the tripartite efflux pump AcrAB-TolC. In addition, I provide in vivo functional data showing that both the length and the amino acid sequence of the ？\-hairpin of AcrA can be flexible for the formation of a functional AcrAB-TolC pump. Genetic-complementation experiments further indicated functional interrelationships between the AcrA hairpin tip region and the TolC aperture tip region. These findings may offer a molecular basis for understanding the multidrug resistance of pathogenic bacteria.
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