[학위논문]Enhancement of Spermidine Content and Antioxidant Capacity by Modulating Ginseng Spermidine synthase Gene in Response to Abiotic and Biotic Stresses원문보기
식물이 비생물학적 및 생물학적 스트레스에 대응하여 이루어지는 방어 기작에 있어서 polyamines (putrescine, spermidine 및 spermine)은 중요한 역할을 한다. 인삼의 뿌리로부터 Spermidine synthase (PgSPD) cDNA 를 분리하였다. 1,188 뉴클레오티드 길이의 cDNA는 1,002 bp의 ORF를 갖고 있었고, 333 잔기의 아미노산을 코딩하고 있었다. GenBank ...
식물이 비생물학적 및 생물학적 스트레스에 대응하여 이루어지는 방어 기작에 있어서 polyamines (putrescine, spermidine 및 spermine)은 중요한 역할을 한다. 인삼의 뿌리로부터 Spermidine synthase (PgSPD) cDNA 를 분리하였다. 1,188 뉴클레오티드 길이의 cDNA는 1,002 bp의 ORF를 갖고 있었고, 333 잔기의 아미노산을 코딩하고 있었다. GenBank BlastX 확인 결과, PgSPD는 Lotus japonicas (78.5%identity, 84% similarity)와 가장 높은 상동성을 갖고 있었다. 염, 저온, ABA, JA, mannitol, CuSO4 과 같은 다양한 환경 스트레스에서의 시간별 PgSPD 유전자의 서로 다른 발현 양상을 확인하였다. 또한, 염 및 저온 스트레스에서의 부정근 내에서의 polyamine (PA) 함량을 측정하였다. 염 스트레스에서, 3개의 PA 합성 관련 유전자 (PgSPD, PgSAMDC, PgADC)는 1 일, 7 일에서 다르게 up-regulation되었다. 염 농도에 의존하여 spermidine (Spd) 와 spermine (Spm)는 상대적으로 함량이 높았으며, putrescine (Put) 함량은 낮아지는 것을 확인하였다. PA 합성 저해제인 cyclohexylamine (CHA) 와 methylglyoxal bis-(guanylhydrazone) (MGBG) 에 의해 PgSPD 와 PgSAMDC는 down-regulation 되었으며 세포 내 PA 함량에 영향을 미쳤다. 또한, 인삼 에 있어서 염에 대응하여 seedling의 성장에 Spd 첨가(0.01, 0.1 and 1 mM) 가 항산화 효소인 CAT, APX, GPX 등과 PA 함량을 증가시켜 도움을 주는 것을 확인하였다. 염 스트레스 동안 Spd 첨가는 Put 축적을 낮춰주고 Spd, Spm 함량을 증가시켜주었다. 그리고 PA 분해 효소 활성과 PA 함량의 관계에 관해서도 연구한 결과, 외부 Spd 증가는 diamine oxidase (DAO) 활성을 증가시키고, 이것은 염에 반응하여 Put 함량을 감소 시키게 된다. 반면, 증가된 Spd와 Spm는 polyamine oxidase (PAO)의 감소를 유도하고, 그 결과 Spd와 Spm의 산화가 감소하게 된다. 0.1 과 1 mM의 Spd 농도에서 가장 효과적인 효과를 보여주었고, 낮은 농도인 0.01 mM에서는 제한적인 효과만 관찰되었다.
인삼의 spermidine synthase 유전자의 기능을 알아보기 위해, 애기장대와 인삼에서 형질전환을 수행하였다. 인삼 PgSPD 단백질이 애기장대의 세포 내 unidentified vesicles에서 관찰됨을 처음 관찰 하였다. 형질전환체는 대조구 식물에 비교하여 높은 함량의 PA가 관찰되었다. 애기장대에 인삼 PgSPD를 과대발현 시킨 식물 (PgSPDox)는 염과 구리 스트레스에 대응하여 유의한 내성을 보여주었고, 염 스트레스에서 PgSPD와 DREB2A 유전자 발현이 증가되었고, Spd 함량이 2 ~ 2.4 배 축적되었다. 증가된 Spd는 항산화 효소 활성을 증가시켰고, MDA와 H2O2 함량을 감소시켰으며, 이에 따라 내성이 증가된 것으로 추정된다. 또한, PgSPDox # 3-6와 PgSPDox # 27-10는 곰팡이 (Fusarium oxysporum)와 박테리아 (Pseudomonas syringae)에서도 내성을 보여주었다. 하지만, PA 대사 효소인 diamine oxidase (DAO)는 F. oxysporum 와 P. syringae 감염 식물에서 증가되었다. 형질전환된 인삼 부정근에서도 PA 함량의 변화를 확인 할 수 있었다. Spd 함량이 세 라인 모두에서 1 ~ 2 배로 증가되는 것을 확인하였고, Put와 Spm 함량도 유의하게 증가하였다. 이러한 실험을 통해 spermidine은 스트레스 전달 경로에서 중요한 조절인자의 역할을 하는 것으로 추정되며, 스트레스 내성 메커니즘을 구축하는 데 중요하다고 시사한다.
식물이 비생물학적 및 생물학적 스트레스에 대응하여 이루어지는 방어 기작에 있어서 polyamines (putrescine, spermidine 및 spermine)은 중요한 역할을 한다. 인삼의 뿌리로부터 Spermidine synthase (PgSPD) cDNA 를 분리하였다. 1,188 뉴클레오티드 길이의 cDNA는 1,002 bp의 ORF를 갖고 있었고, 333 잔기의 아미노산을 코딩하고 있었다. GenBank BlastX 확인 결과, PgSPD는 Lotus japonicas (78.5%identity, 84% similarity)와 가장 높은 상동성을 갖고 있었다. 염, 저온, ABA, JA, mannitol, CuSO4 과 같은 다양한 환경 스트레스에서의 시간별 PgSPD 유전자의 서로 다른 발현 양상을 확인하였다. 또한, 염 및 저온 스트레스에서의 부정근 내에서의 polyamine (PA) 함량을 측정하였다. 염 스트레스에서, 3개의 PA 합성 관련 유전자 (PgSPD, PgSAMDC, PgADC)는 1 일, 7 일에서 다르게 up-regulation되었다. 염 농도에 의존하여 spermidine (Spd) 와 spermine (Spm)는 상대적으로 함량이 높았으며, putrescine (Put) 함량은 낮아지는 것을 확인하였다. PA 합성 저해제인 cyclohexylamine (CHA) 와 methylglyoxal bis-(guanylhydrazone) (MGBG) 에 의해 PgSPD 와 PgSAMDC는 down-regulation 되었으며 세포 내 PA 함량에 영향을 미쳤다. 또한, 인삼 에 있어서 염에 대응하여 seedling의 성장에 Spd 첨가(0.01, 0.1 and 1 mM) 가 항산화 효소인 CAT, APX, GPX 등과 PA 함량을 증가시켜 도움을 주는 것을 확인하였다. 염 스트레스 동안 Spd 첨가는 Put 축적을 낮춰주고 Spd, Spm 함량을 증가시켜주었다. 그리고 PA 분해 효소 활성과 PA 함량의 관계에 관해서도 연구한 결과, 외부 Spd 증가는 diamine oxidase (DAO) 활성을 증가시키고, 이것은 염에 반응하여 Put 함량을 감소 시키게 된다. 반면, 증가된 Spd와 Spm는 polyamine oxidase (PAO)의 감소를 유도하고, 그 결과 Spd와 Spm의 산화가 감소하게 된다. 0.1 과 1 mM의 Spd 농도에서 가장 효과적인 효과를 보여주었고, 낮은 농도인 0.01 mM에서는 제한적인 효과만 관찰되었다.
인삼의 spermidine synthase 유전자의 기능을 알아보기 위해, 애기장대와 인삼에서 형질전환을 수행하였다. 인삼 PgSPD 단백질이 애기장대의 세포 내 unidentified vesicles에서 관찰됨을 처음 관찰 하였다. 형질전환체는 대조구 식물에 비교하여 높은 함량의 PA가 관찰되었다. 애기장대에 인삼 PgSPD를 과대발현 시킨 식물 (PgSPDox)는 염과 구리 스트레스에 대응하여 유의한 내성을 보여주었고, 염 스트레스에서 PgSPD와 DREB2A 유전자 발현이 증가되었고, Spd 함량이 2 ~ 2.4 배 축적되었다. 증가된 Spd는 항산화 효소 활성을 증가시켰고, MDA와 H2O2 함량을 감소시켰으며, 이에 따라 내성이 증가된 것으로 추정된다. 또한, PgSPDox # 3-6와 PgSPDox # 27-10는 곰팡이 (Fusarium oxysporum)와 박테리아 (Pseudomonas syringae)에서도 내성을 보여주었다. 하지만, PA 대사 효소인 diamine oxidase (DAO)는 F. oxysporum 와 P. syringae 감염 식물에서 증가되었다. 형질전환된 인삼 부정근에서도 PA 함량의 변화를 확인 할 수 있었다. Spd 함량이 세 라인 모두에서 1 ~ 2 배로 증가되는 것을 확인하였고, Put와 Spm 함량도 유의하게 증가하였다. 이러한 실험을 통해 spermidine은 스트레스 전달 경로에서 중요한 조절인자의 역할을 하는 것으로 추정되며, 스트레스 내성 메커니즘을 구축하는 데 중요하다고 시사한다.
Polyamines (putrescine, spermidine and spermine) play pivotal roles in plant defense to different abiotic and biotic stresses. A full length Spermidine synthase (PgSPD) cDNA was isolated and characterized from the root of Panax ginseng C. A. Meyer. The cDNA was 1,188 nucleotides long and had an open...
Polyamines (putrescine, spermidine and spermine) play pivotal roles in plant defense to different abiotic and biotic stresses. A full length Spermidine synthase (PgSPD) cDNA was isolated and characterized from the root of Panax ginseng C. A. Meyer. The cDNA was 1,188 nucleotides long and had an open reading frame of 1,002 bp with a deduced amino acid sequence of 333 residues. A GenBank BlastX search revealed that the deduced amino acid of PgSPD shares a high degree homology with the Lotus japonicas (78.5%identity, 84% similarity). In the present study, PgSPD gene shows different profiles of expression in response to various environmental stresses such as, salt, chilling, abscisic acid, jasmonic acid, mannitol and CuSO4 at different time points. We also determined polyamine (PA) content in adventitious roots under salt and chilling stress. Under salt stress, three PA biosynthetic genes, (PgSPD, PgSAMDC and PgADC) showed differential up-regulation patterns after 1 and 7 days in ginseng hairy roots. The modulation of gene expression resulted in the elevation of total PA content with relatively high levels of spermidine (Spd) and spermine (Spm), while putrescine (Put) levels diminished depending on the salt concentrations. Further, PA biosynthesis inhibitors such as cyclohexylamine (CHA) and methylglyoxal bis-(guanylhydrazone) (MGBG) mediated down-regulation of PgSPD and PgSAMDC, and affected cellular PA levels. We also observed that exogenous Spd application (0.01, 0.1 and 1 mM) to saline medium increased the seedlings growth of ginseng by increasing in PA level and the activities of antioxidant enzymes like CAT, APX and GPX. During salinity stress, Spd was effective in lowering the Put accumulation and strikingly increase the Spd and Spm level in ginseng seedlings. In the present study a possible positive correlation has emerged between PA degradative enzyme activity and PA content. This can be accredited that exogenous Spd increased diamine oxidase (DAO) activity which corresponded to decreased Put content in response to salinity. On the other hand, the increased contents of Spd and Spm could be attributed to a considerable reduction of polyamine oxidase (PAO), as a result, oxidation of Spd and Spm was decreased. These positive effects were observed in the case of 0.1 and 1 mM Spd concentration, but a lower concentration (0.01 mM) had a very limited effect. In order to understand the function of ginseng Spermidine synthase gene, transgenic plant was generated in Arabidopsis and ginseng. The transgenic plants exhibited high levels of PAs compared to the untransformed control plants. Ginseng PgSPD overexpressed (PgSPDox) in Arabidopsis plants showed significant tolerance against salt and copper stresses. PgSPDox lines in Arabidopsis showed enhanced expression of PgSPD and DREB2A under salt stress. Indeed, both the PgSPDox lines also accumulated Spd about 2 to 2.4-fold higher than WT upon exposure to salt stress. These increased Spd also showed higher antioxidant enzyme activities, less MDA and H2O2 content under salt stress than the WT, implying it suffered from less injury. Furthermore, we find out the first experimental result that the PgSPD protein is localized to unidentified intracellular vesicles in Arabidopsis. The transgenic lines PgSPDox # 3-6 and PgSPDox # 27-10 also showed increased resistance against fungus (Fusarium oxysporum) and bacterial (Pseudomonas syringae). However, an activity of the PA catabolic enzyme, diamine oxidase (DAO) was increased significantly in F. oxysporum and P. syringae infected transgenic plants. In case of transgenic ginseng adventitious root, the PA contents were also considerably modified by the expression of PgSPD. The Spd contents of transgenic lines, T1, T2 and T3 were 1-2-fold higher than those of the non-transgenic, respectively. Similarly, the transgenic lines Put and Spm contents were also increased significantly than those of the non-transgenic lines. These results strongly suggest an important role of spermidine as a signaling regulator in stress signaling pathways, leading to build-up of stress tolerance mechanisms.
Polyamines (putrescine, spermidine and spermine) play pivotal roles in plant defense to different abiotic and biotic stresses. A full length Spermidine synthase (PgSPD) cDNA was isolated and characterized from the root of Panax ginseng C. A. Meyer. The cDNA was 1,188 nucleotides long and had an open reading frame of 1,002 bp with a deduced amino acid sequence of 333 residues. A GenBank BlastX search revealed that the deduced amino acid of PgSPD shares a high degree homology with the Lotus japonicas (78.5%identity, 84% similarity). In the present study, PgSPD gene shows different profiles of expression in response to various environmental stresses such as, salt, chilling, abscisic acid, jasmonic acid, mannitol and CuSO4 at different time points. We also determined polyamine (PA) content in adventitious roots under salt and chilling stress. Under salt stress, three PA biosynthetic genes, (PgSPD, PgSAMDC and PgADC) showed differential up-regulation patterns after 1 and 7 days in ginseng hairy roots. The modulation of gene expression resulted in the elevation of total PA content with relatively high levels of spermidine (Spd) and spermine (Spm), while putrescine (Put) levels diminished depending on the salt concentrations. Further, PA biosynthesis inhibitors such as cyclohexylamine (CHA) and methylglyoxal bis-(guanylhydrazone) (MGBG) mediated down-regulation of PgSPD and PgSAMDC, and affected cellular PA levels. We also observed that exogenous Spd application (0.01, 0.1 and 1 mM) to saline medium increased the seedlings growth of ginseng by increasing in PA level and the activities of antioxidant enzymes like CAT, APX and GPX. During salinity stress, Spd was effective in lowering the Put accumulation and strikingly increase the Spd and Spm level in ginseng seedlings. In the present study a possible positive correlation has emerged between PA degradative enzyme activity and PA content. This can be accredited that exogenous Spd increased diamine oxidase (DAO) activity which corresponded to decreased Put content in response to salinity. On the other hand, the increased contents of Spd and Spm could be attributed to a considerable reduction of polyamine oxidase (PAO), as a result, oxidation of Spd and Spm was decreased. These positive effects were observed in the case of 0.1 and 1 mM Spd concentration, but a lower concentration (0.01 mM) had a very limited effect. In order to understand the function of ginseng Spermidine synthase gene, transgenic plant was generated in Arabidopsis and ginseng. The transgenic plants exhibited high levels of PAs compared to the untransformed control plants. Ginseng PgSPD overexpressed (PgSPDox) in Arabidopsis plants showed significant tolerance against salt and copper stresses. PgSPDox lines in Arabidopsis showed enhanced expression of PgSPD and DREB2A under salt stress. Indeed, both the PgSPDox lines also accumulated Spd about 2 to 2.4-fold higher than WT upon exposure to salt stress. These increased Spd also showed higher antioxidant enzyme activities, less MDA and H2O2 content under salt stress than the WT, implying it suffered from less injury. Furthermore, we find out the first experimental result that the PgSPD protein is localized to unidentified intracellular vesicles in Arabidopsis. The transgenic lines PgSPDox # 3-6 and PgSPDox # 27-10 also showed increased resistance against fungus (Fusarium oxysporum) and bacterial (Pseudomonas syringae). However, an activity of the PA catabolic enzyme, diamine oxidase (DAO) was increased significantly in F. oxysporum and P. syringae infected transgenic plants. In case of transgenic ginseng adventitious root, the PA contents were also considerably modified by the expression of PgSPD. The Spd contents of transgenic lines, T1, T2 and T3 were 1-2-fold higher than those of the non-transgenic, respectively. Similarly, the transgenic lines Put and Spm contents were also increased significantly than those of the non-transgenic lines. These results strongly suggest an important role of spermidine as a signaling regulator in stress signaling pathways, leading to build-up of stress tolerance mechanisms.
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