스포츠에서 선수들의 약물 복용 여부를 확인하기 위한 도핑분석은 금지약물들을 1차 스크리닝 (screening)하는 단계와 스크리닝에서 검출된 물질에 대하여 2차 확인 (confirmation)하는 단계로 이루어진다. 현재의 도핑분석은 금지약물들의 분류항목에 따라 각각 분리된 방법 (약 7개의 방법)으로 수행되기 때문에 많은 인력과 기기, 그리고 높은 분석 비용이 필요하다. 따라서 Part 1에서는 도핑 시료의 고효율 처리를 위해 초고압액체크로마토그래피 – 탠덤질량분석기 (UFLC-MS/MS)를 이용한 ...
스포츠에서 선수들의 약물 복용 여부를 확인하기 위한 도핑분석은 금지약물들을 1차 스크리닝 (screening)하는 단계와 스크리닝에서 검출된 물질에 대하여 2차 확인 (confirmation)하는 단계로 이루어진다. 현재의 도핑분석은 금지약물들의 분류항목에 따라 각각 분리된 방법 (약 7개의 방법)으로 수행되기 때문에 많은 인력과 기기, 그리고 높은 분석 비용이 필요하다. 따라서 Part 1에서는 도핑 시료의 고효율 처리를 위해 초고압액체크로마토그래피 – 탠덤질량분석기 (UFLC-MS/MS)를 이용한 스크리닝 방법과 2차 확인법을 개발하였다. 소변시료는 엔자임 가수분해가 끝난 뒤 각각 산과염기의 pH에서 액체-액체 추출법으로 2회 추출되었다. 추출된 용액은 질소농축기를 이용하여 모두 증발 시킨 후 200 µL의 2% 포름산이 포함된 메탄올에 재용해 한 뒤 UFLC-MS/MS로 분석하였다. 스크리닝 방법은 질량분석기에서 dwell time의 증가를 위해 머무름 시간 ± 30초만 모니터링 하도록 최적화된 scheduled SRM mode로 개발되었다. 크로마토그래피를 위하여 Kinetex C18 컬럼과 0.1% 포름산이 각각 포함된 증류수와 메탄올의 기울기용매 조건을 사용하였으며, 221종의 금지물질들은 10분 안에 높은 분리능과 매우 좁은 피크 넓이로 검출되었다. 2차 확인법은 product ion scan 모드를 사용하였으며, 크로마토그래피는 스크리닝 방법과 동일한 조건을 사용하여 개발되었다. 현재 개발된 UFLC-MS/MS 방법은 ESI에서 이온화가 어려운 몇몇 스테로이드를 제외한 나머지 금지물질을 모두 포함할 수 있는 방법이다. 그러나 스테로이드들은 이온화의 어려움 때문에 기체크로마토그래피-질량분석기 (GC-MSD) 에 의하여 분석되고 있다. Part II에서는 스테로이드 분석을 위해 현재 사용되고 있는 기체크로마토그래피-질량분석기 (GC-MSD) 방법에 대한 단점을 보완하기 위한 새로운 기체크로마토그래피-전자분무이온화/질량분석기 (GC-ESI/HRMS)를 개발하였다. 기체크로마토그래피는 ESI가 장착된 질량분석기에 자체 제작한 온도 조절이 가능한 컬럼 트랜스퍼라인 (self-made heated column transfer line) 으로 연결되었다. 컬럼 트랜스퍼라인은 분석컬럼이 통과하기 때문에 280도의 온도유지가 매우 중요하며, 그 이하의 온도에서는 분석물질이 컬럼에 흡착되어 물질이 검출되지 않거나 심각한 피크 끌림 현상이 야기되었다. 개발된 기기는 이온화 효율을 증가시키기 위해 ESI 용매, nebulizer 가스, 용매의 유속등에 대해 최적화 되었고, 구조적으로 차이가 있는 14종의 스테로이드에 대해 적용되었다. 그 결과 기체크로마토그래피로부터 용출된 가스상태의 분석물질들은 ESI에서 스프레이되는 용매와 함께 이온화되어 검출되었다. 14종 물질에 대한 GC-ESI/HRMS 스펙트럼에서 케톤기를 포함한 스테로이드는 [M+H]+ 이온이 검출되었고, 오직 하이드록시기만 갖는 물질들은 [M+H]+ 이온은 검출되지 않았으나 물이 떨어진 [M+H-H2O]+ 또는 [M+H-2H2O]+ 이온들이 높게 검출되었다. 현재 GC-ESI/HRMS 연구에서 이온화 메커니즘은 기존에 보고된 논문들을 토대로 두 가지가 가능하나, 액체크로마토그래피-전자분무이온화/질량분석기(LC-ESI/MS)와 매우 유사한 스펙트럼을 생성하므로 LC-ESI/MS와 동일한 ion evaporation 메카니즘이라고 추측된다. 새로 개발된 기체크로마토그래피-전자분무이온화/질량분석기 (GC-ESI/HRMS)는 높은 크로마토그래피 분리능과 낮은 에너지에 의한 이온화 방법을 제공한다.
스포츠에서 선수들의 약물 복용 여부를 확인하기 위한 도핑분석은 금지약물들을 1차 스크리닝 (screening)하는 단계와 스크리닝에서 검출된 물질에 대하여 2차 확인 (confirmation)하는 단계로 이루어진다. 현재의 도핑분석은 금지약물들의 분류항목에 따라 각각 분리된 방법 (약 7개의 방법)으로 수행되기 때문에 많은 인력과 기기, 그리고 높은 분석 비용이 필요하다. 따라서 Part 1에서는 도핑 시료의 고효율 처리를 위해 초고압액체크로마토그래피 – 탠덤질량분석기 (UFLC-MS/MS)를 이용한 스크리닝 방법과 2차 확인법을 개발하였다. 소변시료는 엔자임 가수분해가 끝난 뒤 각각 산과 염기의 pH에서 액체-액체 추출법으로 2회 추출되었다. 추출된 용액은 질소농축기를 이용하여 모두 증발 시킨 후 200 µL의 2% 포름산이 포함된 메탄올에 재용해 한 뒤 UFLC-MS/MS로 분석하였다. 스크리닝 방법은 질량분석기에서 dwell time의 증가를 위해 머무름 시간 ± 30초만 모니터링 하도록 최적화된 scheduled SRM mode로 개발되었다. 크로마토그래피를 위하여 Kinetex C18 컬럼과 0.1% 포름산이 각각 포함된 증류수와 메탄올의 기울기용매 조건을 사용하였으며, 221종의 금지물질들은 10분 안에 높은 분리능과 매우 좁은 피크 넓이로 검출되었다. 2차 확인법은 product ion scan 모드를 사용하였으며, 크로마토그래피는 스크리닝 방법과 동일한 조건을 사용하여 개발되었다. 현재 개발된 UFLC-MS/MS 방법은 ESI에서 이온화가 어려운 몇몇 스테로이드를 제외한 나머지 금지물질을 모두 포함할 수 있는 방법이다. 그러나 스테로이드들은 이온화의 어려움 때문에 기체크로마토그래피-질량분석기 (GC-MSD) 에 의하여 분석되고 있다. Part II에서는 스테로이드 분석을 위해 현재 사용되고 있는 기체크로마토그래피-질량분석기 (GC-MSD) 방법에 대한 단점을 보완하기 위한 새로운 기체크로마토그래피-전자분무이온화/질량분석기 (GC-ESI/HRMS)를 개발하였다. 기체크로마토그래피는 ESI가 장착된 질량분석기에 자체 제작한 온도 조절이 가능한 컬럼 트랜스퍼라인 (self-made heated column transfer line) 으로 연결되었다. 컬럼 트랜스퍼라인은 분석컬럼이 통과하기 때문에 280도의 온도유지가 매우 중요하며, 그 이하의 온도에서는 분석물질이 컬럼에 흡착되어 물질이 검출되지 않거나 심각한 피크 끌림 현상이 야기되었다. 개발된 기기는 이온화 효율을 증가시키기 위해 ESI 용매, nebulizer 가스, 용매의 유속등에 대해 최적화 되었고, 구조적으로 차이가 있는 14종의 스테로이드에 대해 적용되었다. 그 결과 기체크로마토그래피로부터 용출된 가스상태의 분석물질들은 ESI에서 스프레이되는 용매와 함께 이온화되어 검출되었다. 14종 물질에 대한 GC-ESI/HRMS 스펙트럼에서 케톤기를 포함한 스테로이드는 [M+H]+ 이온이 검출되었고, 오직 하이드록시기만 갖는 물질들은 [M+H]+ 이온은 검출되지 않았으나 물이 떨어진 [M+H-H2O]+ 또는 [M+H-2H2O]+ 이온들이 높게 검출되었다. 현재 GC-ESI/HRMS 연구에서 이온화 메커니즘은 기존에 보고된 논문들을 토대로 두 가지가 가능하나, 액체크로마토그래피-전자분무이온화/질량분석기(LC-ESI/MS)와 매우 유사한 스펙트럼을 생성하므로 LC-ESI/MS와 동일한 ion evaporation 메카니즘이라고 추측된다. 새로 개발된 기체크로마토그래피-전자분무이온화/질량분석기 (GC-ESI/HRMS)는 높은 크로마토그래피 분리능과 낮은 에너지에 의한 이온화 방법을 제공한다.
Doping analysis consists of the screening step of the prohibited substances and the confirmatory step of a specific substance found at the screening step, within a limited time period. Traditional screening procedures were commonly set up on a different analytical method in accordance with classes o...
Doping analysis consists of the screening step of the prohibited substances and the confirmatory step of a specific substance found at the screening step, within a limited time period. Traditional screening procedures were commonly set up on a different analytical method in accordance with classes of the prohibited substances and thus required a lot of human resources and instruments. In part I, a rapid multiresidue screening and generic confirmation method were developed using ultra-fast liquid chromatography/tandem mass spectrometry (UFLC-MS/MS) for high throughput efficiency in doping analysis. The urine samples were extracted by two consecutive liquid-liquid extractions at the different pH after enzymatic hydrolysis and analyzed by UFLC-MS/MS with the fast polarity switching and the time-dependent selected reaction monitoring (EZ-method). Taking advantage of higher peak resolution and very narrow peak width of UFLC, total 221 substances from diverse classes on the prohibited list could be successfully identified within a short analytical time of 10 min. Doping analysis can be achieved with single UFLC-MS/MS method for all prohibited substances except for some of anabolic steroids detected only by the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method due to hard ionization in electrospray ionization (ESI) source. In part II, a novel gas chromatography-electrospray ionization/orbitrap mass spectrometry (GC-ESI/HRMS) was developed for anabolic steroids. GC and ESI source were connected by self-made heated column transfer line. The interface is simple and can easily be set up in any mass spectrometer equipped with an ESI source, which is the most commonly used ion source in LC-MS instrument. The GC-ESI/HRMS system was optimized to increase ionization efficiency and was applied for 14 anabolic steroids. Methanol contained 0.1% formic acid was used as the ESI solvent. The protonated molecular ion ([M+H]+) was observed in the GC-ESI/HRMS spectra of steroids containing a ketone group or nitrogen. In the spectra of steroids containing only a hydroxyl group, [M+H-H2O]+ and [M+H-2H2O]+ ions without [M+H]+ ion were observed. In GC-ESI/HRMS, two ionization mechanisms are possible. First, the gas-phase analyte eluted by GC is dissolved into the charged droplet generated by ESI, and then the ionization process occurs by ion evaporation. Second, a proton is transferred from protonated solvent to gas-phase analyte. In this study, there are many consistencies in the spectrum between GC-ESI/HRMS and LC-ESI/MS, which strongly suggests that GC-ESI/HRMS mainly follows ion evaporation mechanism. A novel GC-ESI/HRMS provides the high chromatographic resolution and the soft ionization process. The technique could be applied to identify anabolic steroids in the future.
Doping analysis consists of the screening step of the prohibited substances and the confirmatory step of a specific substance found at the screening step, within a limited time period. Traditional screening procedures were commonly set up on a different analytical method in accordance with classes of the prohibited substances and thus required a lot of human resources and instruments. In part I, a rapid multiresidue screening and generic confirmation method were developed using ultra-fast liquid chromatography/tandem mass spectrometry (UFLC-MS/MS) for high throughput efficiency in doping analysis. The urine samples were extracted by two consecutive liquid-liquid extractions at the different pH after enzymatic hydrolysis and analyzed by UFLC-MS/MS with the fast polarity switching and the time-dependent selected reaction monitoring (EZ-method). Taking advantage of higher peak resolution and very narrow peak width of UFLC, total 221 substances from diverse classes on the prohibited list could be successfully identified within a short analytical time of 10 min. Doping analysis can be achieved with single UFLC-MS/MS method for all prohibited substances except for some of anabolic steroids detected only by the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method due to hard ionization in electrospray ionization (ESI) source. In part II, a novel gas chromatography-electrospray ionization/orbitrap mass spectrometry (GC-ESI/HRMS) was developed for anabolic steroids. GC and ESI source were connected by self-made heated column transfer line. The interface is simple and can easily be set up in any mass spectrometer equipped with an ESI source, which is the most commonly used ion source in LC-MS instrument. The GC-ESI/HRMS system was optimized to increase ionization efficiency and was applied for 14 anabolic steroids. Methanol contained 0.1% formic acid was used as the ESI solvent. The protonated molecular ion ([M+H]+) was observed in the GC-ESI/HRMS spectra of steroids containing a ketone group or nitrogen. In the spectra of steroids containing only a hydroxyl group, [M+H-H2O]+ and [M+H-2H2O]+ ions without [M+H]+ ion were observed. In GC-ESI/HRMS, two ionization mechanisms are possible. First, the gas-phase analyte eluted by GC is dissolved into the charged droplet generated by ESI, and then the ionization process occurs by ion evaporation. Second, a proton is transferred from protonated solvent to gas-phase analyte. In this study, there are many consistencies in the spectrum between GC-ESI/HRMS and LC-ESI/MS, which strongly suggests that GC-ESI/HRMS mainly follows ion evaporation mechanism. A novel GC-ESI/HRMS provides the high chromatographic resolution and the soft ionization process. The technique could be applied to identify anabolic steroids in the future.
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