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DNA 마이크로어레이 (DNA 칩)는 질병과 관련된 많은 유전자의 돌연변이나 바이러스와 같은 감염원의 존재 유무를 한 번에 진단할 수 있는 유용한 기술이다. 많은 장점에도 불구하고, 복잡한 과정 때문에 이 방법은 진단 목적으로 널리 이용되지 못하고 있다 (예를 들면, 핵산의 분리정제, 핵산의 증폭, 탐침자와의 혼성화 그리고, 결과 분석의 과정). 이 연구의 목적은 노동력, 비용, 시간, 그리고 많은 조종을 줄일 뿐만 아니라 DNA 마이크로어레이를 자동화에 쉽게 적용하기 위해서 주요 단계를 통합했다. 이 연구에서, 우리는 DNA 증폭과 유리 슬라이드와 같은 고체표면에 부착된 탐침자와의 혼성화를 ...

DNA 마이크로어레이 (DNA 칩)는 질병과 관련된 많은 유전자의 돌연변이나 바이러스와 같은 감염원의 존재 유무를 한 번에 진단할 수 있는 유용한 기술이다. 많은 장점에도 불구하고, 복잡한 과정 때문에 이 방법은 진단 목적으로 널리 이용되지 못하고 있다 (예를 들면, 핵산의 분리정제, 핵산의 증폭, 탐침자와의 혼성화 그리고, 결과 분석의 과정). 이 연구의 목적은 노동력, 비용, 시간, 그리고 많은 조종을 줄일 뿐만 아니라 DNA 마이크로어레이를 자동화에 쉽게 적용하기 위해서 주요 단계를 통합했다. 이 연구에서, 우리는 DNA 증폭과 유리 슬라이드와 같은 고체표면에 부착된 탐침자와의 혼성화를 PCR 반응 용액을 그대로 사용할 수 있다는 것을 발견했다. 게다가, PCR 반응 용액에서의 혼성화는 검출 한계뿐만 아니라 5배정도의 시그널이 증가했다. 또한, 비대칭 PCR의 사용은 혼성화 과정에서 다수의 PCR 증폭 산물과 한 개의 탐침자와의 사이에서 가지상 DNA의 조립을 증대시킨다는 것을 알아냈다. 종합적으로, 이것은 혼성화 용액에서 PCR 산물의 혼성화시키는 일반적인 방법과 비교해서 30배 정도의 시그널이 증가했다. 이 방법은 높은 시그널과 배경의 차이로 한 개의 분자를 검출할 수 있는 대단히 향상된 민감도를 제공한다. 우리는 환자의 자궁경부 검체에 있는 HPV(Human papillomavirus) DNA의 정확한 유전형 분석에 이 방법을 적용했다. 또한, 자궁경부 세포에서의 DNA의 분리를 간단한 열처리로 할 수 있었고, 이것은 chip위에서 PCR과 혼성화에 적합하다는 것을 알아냈다. 그러므로, 이 간단한 방법은 HPV 감염 진단에 대해서 통합된 방법으로 유리하게 적용될 수 있다. 통합된 과정은 다른 방법에 의한 DNA 증폭과 탐침자와의 혼성화뿐만 아니라 DNA 마이크로어레이를 이용한 진단의 자동화로 발전될 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

DNA microarray (DNA chip) is a powerful technology which allows diagnosis of many target nucleic acid molecules for disease-causing mutations or presence and absence of infectious agents such as viruses all at once. In spite of the major advantage, the method is not widely used for diagnostic purpos...

DNA microarray (DNA chip) is a powerful technology which allows diagnosis of many target nucleic acid molecules for disease-causing mutations or presence and absence of infectious agents such as viruses all at once. In spite of the major advantage, the method is not widely used for diagnostic purposes due to the cumbersome processes involved in the use of the method (For example, purification of nucleic acids, amplification of target nucleic acid sequences, hybridization with capture oligonucleotide probes, and scanning of the chip for the labeled spots). The purpose of this study was integration of the major steps used in the diagnosis by DNA microarray so that the integrated process can be easily adopted for automation of the diagnosis by DNA microarray as well for saving of labor, cost, time and multiple manipulations. In this study, I discovered that the DNA amplification and hybridization of the amplified DNA with the capture oligonucleotide probes immobilized on the surface of solid support such as glass slide can be performed all in the same PCR reaction mixture in the chamber assembled on the surface of DNA microarray slide. In addition, the hybridization step in the PCR reaction mixture increases the signal about 5 fold as well as detection limit. I discovered also that use of asymmetric PCR promotes assembly of branched DNA between several strands of PCR product and one molecule of capture probe during the hybridization step. Overall this resulted in about 30 fold increase in signal compared to the conventional method such as hybridization of PCR product in a buffer solution. The method also produces tremendous increase in sensitivity of detection to the extent of one molecule of target DNA with high signal/noise ratio. I have successfully applied the method to correct genotyping of HPV DNA in the cervical specimens of human patients. I also found that the cervical cells can be simply heated in a solution to release the DNA which is satisfactory for PCR and hybridization on chip. Thus, this simple method can be advantageously adopted for the integrated process of diagnosis of HPV infection. The integrated process should be applicable for automation of diagnosis by DNA microarray as well as by other methods that involve DNA amplification and hybridization with oligonucleotide probes.

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