마이코플라즈마는 세포벽이 없는 소형 세균으로 그람염색에 반응하지 않으며, 베타 락탐 계열과 같은 일반적인 항생제에도 감수성이 떨어지는 세균이다. 마이코플라즈마 세균은 수백 종이 있으며, 사람과 동물에서 점막에 감염되어 호흡기 또는 생식기 계통의 염증과 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 마이코플라즈마 세균은 배양이 어렵고 감염 시 치료가 잘되지 않으며 효과적인 예방법 마련에 어려움을 겪는 세균이다. 또한, 식품이나 의약품 제조 과정에서 그리고 일반적인 세포배양에 있어 심각한 오염원 중의 하나로 알려져 있다. 마이코플라즈마는 1 μm 정도의 작은 크기의 세균이기 때문에 일반적인 현미경 검사로는 오염 여부를 확인하기 어렵다. 특히 세포배양 시 마이코플라스마에 오염되면, 세포의 ...
마이코플라즈마는 세포벽이 없는 소형 세균으로 그람염색에 반응하지 않으며, 베타 락탐 계열과 같은 일반적인 항생제에도 감수성이 떨어지는 세균이다. 마이코플라즈마 세균은 수백 종이 있으며, 사람과 동물에서 점막에 감염되어 호흡기 또는 생식기 계통의 염증과 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 마이코플라즈마 세균은 배양이 어렵고 감염 시 치료가 잘되지 않으며 효과적인 예방법 마련에 어려움을 겪는 세균이다. 또한, 식품이나 의약품 제조 과정에서 그리고 일반적인 세포배양에 있어 심각한 오염원 중의 하나로 알려져 있다. 마이코플라즈마는 1 μm 정도의 작은 크기의 세균이기 때문에 일반적인 현미경 검사로는 오염 여부를 확인하기 어렵다. 특히 세포배양 시 마이코플라스마에 오염되면, 세포의 염색질 응결 및 세포의 변형과 심한 경우 실험실에서 소중히 유지되던 세포주의 사용을 어렵게 만들며, 생물학 제품의 경우 생산하는 제품의 생산수율과 품질이 저하되고 신뢰할 수 있는 실험 결과를 얻지 못하게 된다. Mycoplasma 감염여부 진단을 위해 그 동안 여러 가지 혈청학적 진단 방법이 연구 되었지만 특이성과 민감도가 낮고, 야외에서의 진단 방법으로 적용하기에 여러 가지 제약이 있는 실정이다. 이러한 제약을 해결하기 위하여 본 연구에서는 수백 종의 다양한 Mycoplasma를 한 번에 검사할 수 있는 polymerase chain reaction (PCR) 방법과 더불어 Mycoplasma의 배양방법을 최적화하고자 하였다. 또한 돼지에서 심각한 호흡기 감염을 유발하여 양돈 산업에 막대한 피해를 입히는 Mycoplasma hyopneumoniae와 Mycoplasma hyorhinis를 선별적으로 확인할 수 있는 종 (species) 특이적인 PCR primer를 개발함으로서 PCR 진단방법의 선택성과 민감도를 확보할 수 있는 진단법을 개발하고자 하였다. 또한, 야외 양돈장에서 호흡기 감염된 돼지의 폐장으로부터 분리한 M. hyopneumoniae 균주를 이용하여 병원성 확인을 위한 동물접종실험의 최적 접종법을 확립하고, 개발된 동물모델을 이용한 동물실험을 통하여 고병원성 균주를 분리 배양하고자 하였다. 본 연구를 통하여 확보된 고병원성 M. hyopneumoniae 균주를 이용하여 향후 효과적인 돼지유행성폐렴 백신 개발 연구를 수행하고자 하였다. 돼지 Mycoplasma 세균은 증식 속도가 매우 낮을 뿐 만 아니라 배양 자체가 어려워 M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis에 대한 대량 증식이 불가능해 백신 개발의 제약요인으로 알려져 있다. 본 연구를 통하여 돼지 Mycoplasma 세균의 배양조건을 최적화함으로서 Mycoplasma 배양 및 증식의 어려움을 극복할 수 있었다. 또한, 본 연구에서 Mycoplasma 배양을 위한 배지조성을 최적화하여 배양한 Mycoplasma를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 consensus PCR 방법을 개발하였고, 특이도와 민감도가 뛰어난 PCR primer를 제조하였다. 본 연구를 통하여 개발된 PCR 방법은 다양한 Mycoplasma를 종류에 관계없이 돼지의 Mycoplasma 감염여부를 한 번의 검사로 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 양돈 농장에서 폐렴 병변이 있는 돼지 폐장을 샘플링 하여 DNA를 추출하고 개발한 PCR방법을 적용하여 Mycoplasma에 해당하는 특이 밴드를 확인할 수 있었다. 또한 M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis에 대한 선택성과 민감도를 향상시킬 수 있는 정 특이적인 PCR primer를 개발하여 적용한 결과 M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis 각각에 특이적이 밴드를 확인하였다. 본 연구를 통하여 Mycoplasma에 감염된 돼지를 대상으로 신속 정확하게 Mycoplasma 감염여부를 확인하는 방법을 매뉴얼화할 수 있었다. Mycoplasma 세균의 생장정도를 측정방법으로 Color Change Unit (CCU)를 적용하는 것이 최적의 세균측정방법임을 확인하였다. M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis를 배양하여 4×108 CCU/ml로 총 6ml을 이용한 최적의 접종방법을 확인하기 위하여 Nebulizer와 Rapid intra nasal, Intra nasal dropping 방법으로 돼지 한쪽 코에 3 ml씩 투여하여 Mycoplasma 세균을 감염시킨 후 swab하여 감염여부를 확인한 결과 Intra nasal dropping 방법이 Mycoplasma 병원성 확인을 위한 동물실험의 최적 접종법으로 확인하였다. 또한, 돼지의 폐장으로부터 매뉴얼화한 샘플링 방법과 최적화된 배지조성을 이용하여 Mycoplasma 감염 돼지로부터 고병원성 야외균주를 분리하여 배양할 수 있음을 확인하였다. 본 연구로부터 수백 종의 Mycoplasma를 한 번에 신속하게 진단할 수 있는 consensus PCR 방법과 M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis에 선택적이고 고감도로 분석할 수 있는 종 특이적인 Primer를 개발하였다. 이러한 신속한 진단방법은 Mycoplasma 감염의 신속 진단 및 분리배양을 위한 효과적인 전략을 제공할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 본 연구에서는 선별한 Mycoplasma를 배양할 수 있는 배지조성의 최적화, 동물실험을 위한 최적의 접종방법 개발, 고병원성 야외균주의 분리 및 대량 증식을 통한 백신 후보 균주를 확보하였다. 본 연구결과를 통하여 개발된 Mycoplasma 배양 및 진단 방법은 효율적인 Mycoplasma 검출 및 분리에 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 본 연구결과 확보한 고병원성 M. hyopneumoniae 야외분리주들은 향후 돼지유행성폐렴의 효율적인 백신개발을 위한 후보균주로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
마이코플라즈마는 세포벽이 없는 소형 세균으로 그람염색에 반응하지 않으며, 베타 락탐 계열과 같은 일반적인 항생제에도 감수성이 떨어지는 세균이다. 마이코플라즈마 세균은 수백 종이 있으며, 사람과 동물에서 점막에 감염되어 호흡기 또는 생식기 계통의 염증과 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 마이코플라즈마 세균은 배양이 어렵고 감염 시 치료가 잘되지 않으며 효과적인 예방법 마련에 어려움을 겪는 세균이다. 또한, 식품이나 의약품 제조 과정에서 그리고 일반적인 세포배양에 있어 심각한 오염원 중의 하나로 알려져 있다. 마이코플라즈마는 1 μm 정도의 작은 크기의 세균이기 때문에 일반적인 현미경 검사로는 오염 여부를 확인하기 어렵다. 특히 세포배양 시 마이코플라스마에 오염되면, 세포의 염색질 응결 및 세포의 변형과 심한 경우 실험실에서 소중히 유지되던 세포주의 사용을 어렵게 만들며, 생물학 제품의 경우 생산하는 제품의 생산수율과 품질이 저하되고 신뢰할 수 있는 실험 결과를 얻지 못하게 된다. Mycoplasma 감염여부 진단을 위해 그 동안 여러 가지 혈청학적 진단 방법이 연구 되었지만 특이성과 민감도가 낮고, 야외에서의 진단 방법으로 적용하기에 여러 가지 제약이 있는 실정이다. 이러한 제약을 해결하기 위하여 본 연구에서는 수백 종의 다양한 Mycoplasma를 한 번에 검사할 수 있는 polymerase chain reaction (PCR) 방법과 더불어 Mycoplasma의 배양방법을 최적화하고자 하였다. 또한 돼지에서 심각한 호흡기 감염을 유발하여 양돈 산업에 막대한 피해를 입히는 Mycoplasma hyopneumoniae와 Mycoplasma hyorhinis를 선별적으로 확인할 수 있는 종 (species) 특이적인 PCR primer를 개발함으로서 PCR 진단방법의 선택성과 민감도를 확보할 수 있는 진단법을 개발하고자 하였다. 또한, 야외 양돈장에서 호흡기 감염된 돼지의 폐장으로부터 분리한 M. hyopneumoniae 균주를 이용하여 병원성 확인을 위한 동물접종실험의 최적 접종법을 확립하고, 개발된 동물모델을 이용한 동물실험을 통하여 고병원성 균주를 분리 배양하고자 하였다. 본 연구를 통하여 확보된 고병원성 M. hyopneumoniae 균주를 이용하여 향후 효과적인 돼지유행성폐렴 백신 개발 연구를 수행하고자 하였다. 돼지 Mycoplasma 세균은 증식 속도가 매우 낮을 뿐 만 아니라 배양 자체가 어려워 M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis에 대한 대량 증식이 불가능해 백신 개발의 제약요인으로 알려져 있다. 본 연구를 통하여 돼지 Mycoplasma 세균의 배양조건을 최적화함으로서 Mycoplasma 배양 및 증식의 어려움을 극복할 수 있었다. 또한, 본 연구에서 Mycoplasma 배양을 위한 배지조성을 최적화하여 배양한 Mycoplasma를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 consensus PCR 방법을 개발하였고, 특이도와 민감도가 뛰어난 PCR primer를 제조하였다. 본 연구를 통하여 개발된 PCR 방법은 다양한 Mycoplasma를 종류에 관계없이 돼지의 Mycoplasma 감염여부를 한 번의 검사로 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 양돈 농장에서 폐렴 병변이 있는 돼지 폐장을 샘플링 하여 DNA를 추출하고 개발한 PCR방법을 적용하여 Mycoplasma에 해당하는 특이 밴드를 확인할 수 있었다. 또한 M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis에 대한 선택성과 민감도를 향상시킬 수 있는 정 특이적인 PCR primer를 개발하여 적용한 결과 M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis 각각에 특이적이 밴드를 확인하였다. 본 연구를 통하여 Mycoplasma에 감염된 돼지를 대상으로 신속 정확하게 Mycoplasma 감염여부를 확인하는 방법을 매뉴얼화할 수 있었다. Mycoplasma 세균의 생장정도를 측정방법으로 Color Change Unit (CCU)를 적용하는 것이 최적의 세균측정방법임을 확인하였다. M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis를 배양하여 4×108 CCU/ml로 총 6ml을 이용한 최적의 접종방법을 확인하기 위하여 Nebulizer와 Rapid intra nasal, Intra nasal dropping 방법으로 돼지 한쪽 코에 3 ml씩 투여하여 Mycoplasma 세균을 감염시킨 후 swab하여 감염여부를 확인한 결과 Intra nasal dropping 방법이 Mycoplasma 병원성 확인을 위한 동물실험의 최적 접종법으로 확인하였다. 또한, 돼지의 폐장으로부터 매뉴얼화한 샘플링 방법과 최적화된 배지조성을 이용하여 Mycoplasma 감염 돼지로부터 고병원성 야외균주를 분리하여 배양할 수 있음을 확인하였다. 본 연구로부터 수백 종의 Mycoplasma를 한 번에 신속하게 진단할 수 있는 consensus PCR 방법과 M. hyopneumoniae와 M. hyorhinis에 선택적이고 고감도로 분석할 수 있는 종 특이적인 Primer를 개발하였다. 이러한 신속한 진단방법은 Mycoplasma 감염의 신속 진단 및 분리배양을 위한 효과적인 전략을 제공할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 본 연구에서는 선별한 Mycoplasma를 배양할 수 있는 배지조성의 최적화, 동물실험을 위한 최적의 접종방법 개발, 고병원성 야외균주의 분리 및 대량 증식을 통한 백신 후보 균주를 확보하였다. 본 연구결과를 통하여 개발된 Mycoplasma 배양 및 진단 방법은 효율적인 Mycoplasma 검출 및 분리에 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한 본 연구결과 확보한 고병원성 M. hyopneumoniae 야외분리주들은 향후 돼지유행성폐렴의 효율적인 백신개발을 위한 후보균주로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
Mycoplasma species are the smallest free-living organisms. These organisms are unique among prokaryotes in that they lack a cell wall, a feature largely responsible for their biologic properties such as their lack of a reaction to Gram stain and their lack of susceptibility to many commonly prescrib...
Mycoplasma species are the smallest free-living organisms. These organisms are unique among prokaryotes in that they lack a cell wall, a feature largely responsible for their biologic properties such as their lack of a reaction to Gram stain and their lack of susceptibility to many commonly prescribed antimicrobial agents, including beta-lactams. Mycoplasma organisms are usually associated with mucosal surfaces, residing extracellularly in the respiratory and urogenital tracts. Because of hardness of cell culture propagation, it is hard to prevent Mycoplasma infection from human and animal. Also, Mycoplasma species are often found in research laboratories as contaminants in cell culture. Mycoplasma cell culture contamination occurs due to contamination from individuals or contaminated cell culture medium ingredients. Mycoplasma cells are physically small ? less than 1 μm ? and they are therefore difficult to detect with a conventional microscope. Mycoplasmas may induce cellular changes, including chromosome aberrations, changes in metabolism and cell growth. Severe Mycoplasma infections may destroy a cell line. Though many ways have been researched and tried to diagnose Mycoplasma infection, they were limited with applying to diagnose for the filed test because of the non-selective specificity and the low sensitivity. It is known that the vaccine against swine mycoplasma infection like as swine enzootic pneumonia is hard to develop because Mycoplasma bacterium propagate so slowly as well as they are hard even to culture into M. hyopneumoniae and M. hyorhinis. To resolve these limitations about the Mycoplasma propagation, this research intended to optimize the ways to culture Mycoplazama. Also, this research intended to develop consensus polymerase chain reaction (PCR) which can examine the hundreds of Mycoplasma at once, and intended to develop species-specific PCR primers with high specificity and sensitivity which is able to identify M. hyopneumoniae and M. hyorhinis selectively. And also this research intended to develop the optimized infection method for the animal inoculation experiment with field isolated Mycoplasma strains and performed to compare the virulence of the field isolated Mycoplasma strains through animal inoculation experiment. As the results, the optimized Mycoplasma culture system was developed. Using the optimized media formula, M. hyopneumoniae and M. hyorhinis could be propagate quickly and efficiently. Also, consensus PCR for Mycoplasma detection was developed. The developed consensus primer pairs, MycoF and MycoR were designed specifically to amplify the 16S ribosomal RNA gene (rRNA) of Mycoplasma species by the optimized PCR system. The developed consensus PCR system effectively amplified 215 bp of Mycoplasma genus-specific region of 16S rRNA. And also the species-specific PCR primers against M. hyopneumoniae and M. hyorhinis was developed. The species-specific PCR primers were revealed high specificity and sensitivity against each M. hyopneumoniae and M. hyorhinis. These results could provide an efficient strategy and method for the rapid and accurate Mycoplasma diagnosis. It is found out that color change unit (CCU) is the best way to measure the degree of bacteria growth. In order to develop the optimized inoculation method for the animal experiment, the inoculation comparison study was performed using Nebulizer or rapid intra nasal or intra nasal dropping method. As the result, intra nasal dropping was reveal the most recommendable method for animal inoculation experiment with M. hyopneumoniae and M. hyorhinis. Also, using the optimized culture system and animal inoculation method, M. hyopneumoniae filed strains with the high virulence were isolated and propagated. In conclusion, in this study, the developed consensus PCR will be useful and effective for monitoring Mycoplasma species in various kinds of animals and human and also cell cultures and could be used for detection of a new Mycoplasma species. Also, the developed the species-specific PCR primers against M. hyopneumoniae and M. hyorhinis could be used to diagnose against each M. hyopneumoniae and M. hyorhinis with the high specificity and sensitivity. These results could provide an efficient strategy and method for the rapid and accurate Mycoplasma diagnosis. Also, in this study, the optimized culture system and animal inoculation method with M. hyopneumoniae and M. hyorhinis were developed and isolated M. hyopneumoniae filed strains with the high virulence. These results could be used for the development of efficient swine mycoplasma vaccine. Keywords: Mycoplasma, culture, M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, consensus PCR, virulence
Mycoplasma species are the smallest free-living organisms. These organisms are unique among prokaryotes in that they lack a cell wall, a feature largely responsible for their biologic properties such as their lack of a reaction to Gram stain and their lack of susceptibility to many commonly prescribed antimicrobial agents, including beta-lactams. Mycoplasma organisms are usually associated with mucosal surfaces, residing extracellularly in the respiratory and urogenital tracts. Because of hardness of cell culture propagation, it is hard to prevent Mycoplasma infection from human and animal. Also, Mycoplasma species are often found in research laboratories as contaminants in cell culture. Mycoplasma cell culture contamination occurs due to contamination from individuals or contaminated cell culture medium ingredients. Mycoplasma cells are physically small ? less than 1 μm ? and they are therefore difficult to detect with a conventional microscope. Mycoplasmas may induce cellular changes, including chromosome aberrations, changes in metabolism and cell growth. Severe Mycoplasma infections may destroy a cell line. Though many ways have been researched and tried to diagnose Mycoplasma infection, they were limited with applying to diagnose for the filed test because of the non-selective specificity and the low sensitivity. It is known that the vaccine against swine mycoplasma infection like as swine enzootic pneumonia is hard to develop because Mycoplasma bacterium propagate so slowly as well as they are hard even to culture into M. hyopneumoniae and M. hyorhinis. To resolve these limitations about the Mycoplasma propagation, this research intended to optimize the ways to culture Mycoplazama. Also, this research intended to develop consensus polymerase chain reaction (PCR) which can examine the hundreds of Mycoplasma at once, and intended to develop species-specific PCR primers with high specificity and sensitivity which is able to identify M. hyopneumoniae and M. hyorhinis selectively. And also this research intended to develop the optimized infection method for the animal inoculation experiment with field isolated Mycoplasma strains and performed to compare the virulence of the field isolated Mycoplasma strains through animal inoculation experiment. As the results, the optimized Mycoplasma culture system was developed. Using the optimized media formula, M. hyopneumoniae and M. hyorhinis could be propagate quickly and efficiently. Also, consensus PCR for Mycoplasma detection was developed. The developed consensus primer pairs, MycoF and MycoR were designed specifically to amplify the 16S ribosomal RNA gene (rRNA) of Mycoplasma species by the optimized PCR system. The developed consensus PCR system effectively amplified 215 bp of Mycoplasma genus-specific region of 16S rRNA. And also the species-specific PCR primers against M. hyopneumoniae and M. hyorhinis was developed. The species-specific PCR primers were revealed high specificity and sensitivity against each M. hyopneumoniae and M. hyorhinis. These results could provide an efficient strategy and method for the rapid and accurate Mycoplasma diagnosis. It is found out that color change unit (CCU) is the best way to measure the degree of bacteria growth. In order to develop the optimized inoculation method for the animal experiment, the inoculation comparison study was performed using Nebulizer or rapid intra nasal or intra nasal dropping method. As the result, intra nasal dropping was reveal the most recommendable method for animal inoculation experiment with M. hyopneumoniae and M. hyorhinis. Also, using the optimized culture system and animal inoculation method, M. hyopneumoniae filed strains with the high virulence were isolated and propagated. In conclusion, in this study, the developed consensus PCR will be useful and effective for monitoring Mycoplasma species in various kinds of animals and human and also cell cultures and could be used for detection of a new Mycoplasma species. Also, the developed the species-specific PCR primers against M. hyopneumoniae and M. hyorhinis could be used to diagnose against each M. hyopneumoniae and M. hyorhinis with the high specificity and sensitivity. These results could provide an efficient strategy and method for the rapid and accurate Mycoplasma diagnosis. Also, in this study, the optimized culture system and animal inoculation method with M. hyopneumoniae and M. hyorhinis were developed and isolated M. hyopneumoniae filed strains with the high virulence. These results could be used for the development of efficient swine mycoplasma vaccine. Keywords: Mycoplasma, culture, M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, consensus PCR, virulence
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