돼지 번식에서 인공수정이 차지하는 비율은 세계적으로 매년 증가하고 있으며, 국내의 경우 약 90%의 보급률로서 매년 180만여 팩의 정액이 소요되는데 (Kim 등, 2011) 대부분을 액상정액에 의존하고 있다. 국내 돼지 인공수정은 2008년 현재 52개 센터에서 년간 1,792두 분의 정액을 유통하며 인공수정 보급률은 전국 모돈 대비 90%에 달하고 있다 (김 등, 2008). 돼지 AI센터에서 배달된 정액은 인공수정 까지 보존하는 동안 정액의 활력 저하가 일어나며 이것은 수태율과 산자수 저하를 초래한다. 정액을 공급받은 농장에서는 인공수정 이후의 수태율이나 산자수의 저 하가 일어났을 때 공급된 정액의 질이 나쁘기 때문이라고 생각하고 공급자는 정자 의 질에는 문제가 없고 종빈돈의 관리 부실에서 일어난 번식효율 저하라고 주장하 여 종종 분쟁을 일으키기도 한다. 인공수정을 통하여 번식을 하는 경우에는 정자의 수정능력을 예측하는 것은 돼 지 번식효율에 있어서 매우 중요한 요인 중의 하나이다 (Ganeda, 2005). 돼지 번식 관리자는 종모축의 물리적인 검정과 일반적인 정액의 상태 (...
돼지 번식에서 인공수정이 차지하는 비율은 세계적으로 매년 증가하고 있으며, 국내의 경우 약 90%의 보급률로서 매년 180만여 팩의 정액이 소요되는데 (Kim 등, 2011) 대부분을 액상정액에 의존하고 있다. 국내 돼지 인공수정은 2008년 현재 52개 센터에서 년간 1,792두 분의 정액을 유통하며 인공수정 보급률은 전국 모돈 대비 90%에 달하고 있다 (김 등, 2008). 돼지 AI센터에서 배달된 정액은 인공수정 까지 보존하는 동안 정액의 활력 저하가 일어나며 이것은 수태율과 산자수 저하를 초래한다. 정액을 공급받은 농장에서는 인공수정 이후의 수태율이나 산자수의 저 하가 일어났을 때 공급된 정액의 질이 나쁘기 때문이라고 생각하고 공급자는 정자 의 질에는 문제가 없고 종빈돈의 관리 부실에서 일어난 번식효율 저하라고 주장하 여 종종 분쟁을 일으키기도 한다. 인공수정을 통하여 번식을 하는 경우에는 정자의 수정능력을 예측하는 것은 돼 지 번식효율에 있어서 매우 중요한 요인 중의 하나이다 (Ganeda, 2005). 돼지 번식 관리자는 종모축의 물리적인 검정과 일반적인 정액의 상태 (concentration, morphology, motility)를 종합적으로 고려하여 실질적인 번식효율을 예측한다 (Ginson, 1989). 정액의 수정능을 평가하는 방법은 sperm motility, sperm viability, sperm morphology, sperm DNA evaluation 등이 있으며, 정자의 기능을 평가하는 방법으로는 sperm-zona pellucida binding test, oocyte penetration assay (Berger 등, 1996), in vitro fertilization assay (Sells 등, 2003), sperm-oviduct binding assay 등이 있다 (Foxcroft 등, 2008). Sperm motility는 암퇘지 생식기를 거쳐 난자로 이동하고 수정되는 과정에서 거 의 절대적인 영향을 미치는 요인으로 수정능력을 예측하는 가장 손쉬운 방법으로이용되고 있다. Flowers (1997)는 정자 운동성은 수정능력을 평가하는 매우 유용한 지표이며 sperm motility 60% 이상의 경우에는 in vitro sperm penetration rate, farrowing rates and litter size에 차이가 없다고 하였다. 그러나 sperm motility는 정자의 수정능력을 평가하는 절대적인 기준이 아니다 (Foxcroft 등, 2008). 체외수 정은 정자의 수정능력을 간접적으로 측정하는 방법 중 가장 상관관계가 높은 지표 로 사용되고 있다 (Ganeda, 2005; Parinaud, 1996). 소의 정액을 체외수정으로 test 한 결과 cleavage and blastocyst formation rates 와 수태율과는 높은 상관관계를 나타낸다고 하였다 (Zhang 등, 1997). 액상정액이 세균에 오염되면 품질 저하는 물론 희석정액의 보존성을 저하시키고, 감염된 병원성 세균은 암컷의 질병을 유발하는 원인이 된다고 알려져 있다 (Maes 등, 2008). 돼지 번식에 있어서 정자의 수정능력은 생산성에 영향을 미치는 중요한 요인 중의 하나인데, 수정능력은 정자의 활력, 기형율, 기능적인 형태, 세균오염 정 도 및 주입정자의 농도 등과 같은 정액의 질과 양에 의하여 영향을 받는다. 미국의 경우, 돼지정액에서 분리한 세균의 종류는 약 13종 이상으로 장내 세균이 주축을 이루고 있고, 장내 세균은 정자 기능을 저해하는 것으로 보고되었다 (Sone, 1982). 국내의 조사에 의하면 인공수정센터에서 제공받은 희석직전의 원정액 중 94.8%가, 희석정액은 19.0%가 세균에 오염되었으며, 이들 세균을 분리한 결과, 10 종의 그람음성균과 5종의 그람양성균이 분리되었다고 하였다 (Jung 등, 2011). 본 실험실의 선행 연구에서 액상정액의 보존일수가 3일까지는 차이가 없었으나, 5일 이상일 경우 유의적인 세균의 증식을 확인하였다 (이, 2007). 돼지 정액의 오염은 생식기 내부보다 외부의 요인이 주된 오염원으로 보고되었다 (Althouse 등, 2000). 돼지 액상정액에 순수 배양된 여러 종류의 세균을 넣었을 때 정자 서로 간에 두부 응집이 일어나고, 전체적인 운동성이 감소되었다 (Althouse, 1999)고 하며, 사람의 정액에서 항생제에 오랫동안 노출된 정자는 운동성과 형태에 영향을 받는다 (Dahlberg, 1990)고 하였다. 세균에 오염된 정액은 세균 농도에 따라 유해성의 정도가 차이가 나는데, 보존기간이나 주변의 청결도 및 희석액에 따라서 세균의 농 도가 변하며, 오염된 정액을 이용하여 인공수정을 할 경우 축군 전체의 번식효율 이 저하된다고 하였다 (Althouse 등, 1998, 2000). 본 연구는 체외수정에 이용되는 sperm motility 와 sperm abnormality 가 체외 수정란 생산효율에 미치는 영향을 구명함으로써 정액의 수정능력을 간접적으로 측 정하여 농장에서 사용가능한 sperm motility를 제시하고 정액의 보존 일수에 따른 세균의 증식 정도를 조사하고, 정자의 기능에 미치는 영향을 구명하여 돼지 액상 정액의 적정 보존일수를 제시하고자 실시하였다.
돼지 번식에서 인공수정이 차지하는 비율은 세계적으로 매년 증가하고 있으며, 국내의 경우 약 90%의 보급률로서 매년 180만여 팩의 정액이 소요되는데 (Kim 등, 2011) 대부분을 액상정액에 의존하고 있다. 국내 돼지 인공수정은 2008년 현재 52개 센터에서 년간 1,792두 분의 정액을 유통하며 인공수정 보급률은 전국 모돈 대비 90%에 달하고 있다 (김 등, 2008). 돼지 AI센터에서 배달된 정액은 인공수정 까지 보존하는 동안 정액의 활력 저하가 일어나며 이것은 수태율과 산자수 저하를 초래한다. 정액을 공급받은 농장에서는 인공수정 이후의 수태율이나 산자수의 저 하가 일어났을 때 공급된 정액의 질이 나쁘기 때문이라고 생각하고 공급자는 정자 의 질에는 문제가 없고 종빈돈의 관리 부실에서 일어난 번식효율 저하라고 주장하 여 종종 분쟁을 일으키기도 한다. 인공수정을 통하여 번식을 하는 경우에는 정자의 수정능력을 예측하는 것은 돼 지 번식효율에 있어서 매우 중요한 요인 중의 하나이다 (Ganeda, 2005). 돼지 번식 관리자는 종모축의 물리적인 검정과 일반적인 정액의 상태 (concentration, morphology, motility)를 종합적으로 고려하여 실질적인 번식효율을 예측한다 (Ginson, 1989). 정액의 수정능을 평가하는 방법은 sperm motility, sperm viability, sperm morphology, sperm DNA evaluation 등이 있으며, 정자의 기능을 평가하는 방법으로는 sperm-zona pellucida binding test, oocyte penetration assay (Berger 등, 1996), in vitro fertilization assay (Sells 등, 2003), sperm-oviduct binding assay 등이 있다 (Foxcroft 등, 2008). Sperm motility는 암퇘지 생식기를 거쳐 난자로 이동하고 수정되는 과정에서 거 의 절대적인 영향을 미치는 요인으로 수정능력을 예측하는 가장 손쉬운 방법으로이용되고 있다. Flowers (1997)는 정자 운동성은 수정능력을 평가하는 매우 유용한 지표이며 sperm motility 60% 이상의 경우에는 in vitro sperm penetration rate, farrowing rates and litter size에 차이가 없다고 하였다. 그러나 sperm motility는 정자의 수정능력을 평가하는 절대적인 기준이 아니다 (Foxcroft 등, 2008). 체외수 정은 정자의 수정능력을 간접적으로 측정하는 방법 중 가장 상관관계가 높은 지표 로 사용되고 있다 (Ganeda, 2005; Parinaud, 1996). 소의 정액을 체외수정으로 test 한 결과 cleavage and blastocyst formation rates 와 수태율과는 높은 상관관계를 나타낸다고 하였다 (Zhang 등, 1997). 액상정액이 세균에 오염되면 품질 저하는 물론 희석정액의 보존성을 저하시키고, 감염된 병원성 세균은 암컷의 질병을 유발하는 원인이 된다고 알려져 있다 (Maes 등, 2008). 돼지 번식에 있어서 정자의 수정능력은 생산성에 영향을 미치는 중요한 요인 중의 하나인데, 수정능력은 정자의 활력, 기형율, 기능적인 형태, 세균오염 정 도 및 주입정자의 농도 등과 같은 정액의 질과 양에 의하여 영향을 받는다. 미국의 경우, 돼지정액에서 분리한 세균의 종류는 약 13종 이상으로 장내 세균이 주축을 이루고 있고, 장내 세균은 정자 기능을 저해하는 것으로 보고되었다 (Sone, 1982). 국내의 조사에 의하면 인공수정센터에서 제공받은 희석직전의 원정액 중 94.8%가, 희석정액은 19.0%가 세균에 오염되었으며, 이들 세균을 분리한 결과, 10 종의 그람음성균과 5종의 그람양성균이 분리되었다고 하였다 (Jung 등, 2011). 본 실험실의 선행 연구에서 액상정액의 보존일수가 3일까지는 차이가 없었으나, 5일 이상일 경우 유의적인 세균의 증식을 확인하였다 (이, 2007). 돼지 정액의 오염은 생식기 내부보다 외부의 요인이 주된 오염원으로 보고되었다 (Althouse 등, 2000). 돼지 액상정액에 순수 배양된 여러 종류의 세균을 넣었을 때 정자 서로 간에 두부 응집이 일어나고, 전체적인 운동성이 감소되었다 (Althouse, 1999)고 하며, 사람의 정액에서 항생제에 오랫동안 노출된 정자는 운동성과 형태에 영향을 받는다 (Dahlberg, 1990)고 하였다. 세균에 오염된 정액은 세균 농도에 따라 유해성의 정도가 차이가 나는데, 보존기간이나 주변의 청결도 및 희석액에 따라서 세균의 농 도가 변하며, 오염된 정액을 이용하여 인공수정을 할 경우 축군 전체의 번식효율 이 저하된다고 하였다 (Althouse 등, 1998, 2000). 본 연구는 체외수정에 이용되는 sperm motility 와 sperm abnormality 가 체외 수정란 생산효율에 미치는 영향을 구명함으로써 정액의 수정능력을 간접적으로 측 정하여 농장에서 사용가능한 sperm motility를 제시하고 정액의 보존 일수에 따른 세균의 증식 정도를 조사하고, 정자의 기능에 미치는 영향을 구명하여 돼지 액상 정액의 적정 보존일수를 제시하고자 실시하였다.
Objective of first study was to suggest usable sperm motility to farms in measuring the effect of sperm motility and sperm abnormality on in vitro production of embryo in which sperm's fertilizing ability can be determined indirectly. Semen samples were provided from local AI center and used within ...
Objective of first study was to suggest usable sperm motility to farms in measuring the effect of sperm motility and sperm abnormality on in vitro production of embryo in which sperm's fertilizing ability can be determined indirectly. Semen samples were provided from local AI center and used within 3 days after collection. Semen samples were divided by 4 different motile groups (>70%; 61～70%; 51～60%; <50%) using CASA (computer-assisted sperm analysis) on the days of IVF. Developmental rate to the blastocyst stage from over 61% motile sperm group showed significantly higher rate than below 60% motile sperm group (16.5±0.7～18.4±0.8% vs 6.3±0.8～11.5±0.7%, p<0.05). In experiment to determine the relationship between sperm motility and viability and abnormality, over 61% motile sperm groups showed significantly higher viability rate compared to below 60% motile sperm groups (84.8±4.0～88.1±4.0% vs 69.1±4.0～74.2±4.0%, p<0.05). On the other hand, morphological sperm abnormality showed significantly higher in over 70% motile sperm group (10.2±2.2 vs 16.0±2.2～21.0±2.2%, p<0.05). The second study was conducted to determine the relationship between elapsed time after semen preservation on the changes of bacteria and semen quality. Semen was diluted with BTS(Beltsville Thawing Solution) extender without antibiotic for 7 days and sperm parameter and fertility were measured. Acrosomal integrity was measured by Chlortetracycline (CTC) staining. CTC patterns were uniform fluorescence over the whole head (pattern F), characteristic of incapacitated acrosome-intact spermatozoa; fluorescence-free band in the post-acrosomal region (pattern B), characteristic of capacitated acrosome-intact spermatozoa; and almost no fluorescence over the whole head except for a thin band in the equatorial segment (pattern AR), characteristic of acrosome reacted spermatozoa. Total number of bacteria was significantly increased (p<0.0001) 3 days after preservation. Sperm motility, viability, and morphological abnormality on elapsed time after preservation were lower from 5 (77.24±6.47, p<0.001) and 7 days (66.1±12.7, p<0.001) after preservation compared to 1 (15.71±7.18) and 3 days (18.39±7.22) after preservation, respectively. Sperm viability was significantly lower (53.25±35.03, p<0.0001) at 7 days after preservation. Morphological abnormality of sperm was lower (p<0.001) at 1 (15.71±7.18) and 3 (18.39±7.22) days compared to 5 (21.84±7.91) and 7 (22.59±9.93) days after preservation. Acrosomal integrity and capacitation rate (pattern F) were significantly lower (p<0.001) from 5 days after preservation. The third study was to determine the efficiency of embryo production in vitro and the relationship between sperm viability and abnormality, boar semen were prepared with different concatenations of bacteria and used for in vitro fertilization. Semen samples were prepared with 5 different levels of bacteria; 0, 3,000, 5,000, 7,000 or 10,000 cfu/ml and were used for in vitro fertilization. For sperm viability and abnormality test, semen samples were stained with fast green FCF (2%) and Eosin B (0.8%). Developmental rate of blastocyst stage was similar in groups (16.0±5.3∼18.4±5.7% in 0∼3,000 cfu/ml), but rates were significantly lower (p<0.01) in 5,000~7,000 cfu/ml group compared to control group (9.0±4.5~9.0±5.4 vs 18.4±5.7%). Bacterial contamination level of 10,000 cfu/ml group showed the lowest embryonic developmental rate (p<0.01) compared to all other groups. The bacterial contamination as much as 10,000 cfu/ml level resulted in significantly lower sperm viability (85.7±10.0%, p<0.01) compared to contaminated levels below 7,000 cfu/ml (92.4±3.6~99.3±0.3%).
Objective of first study was to suggest usable sperm motility to farms in measuring the effect of sperm motility and sperm abnormality on in vitro production of embryo in which sperm's fertilizing ability can be determined indirectly. Semen samples were provided from local AI center and used within 3 days after collection. Semen samples were divided by 4 different motile groups (>70%; 61～70%; 51～60%; <50%) using CASA (computer-assisted sperm analysis) on the days of IVF. Developmental rate to the blastocyst stage from over 61% motile sperm group showed significantly higher rate than below 60% motile sperm group (16.5±0.7～18.4±0.8% vs 6.3±0.8～11.5±0.7%, p<0.05). In experiment to determine the relationship between sperm motility and viability and abnormality, over 61% motile sperm groups showed significantly higher viability rate compared to below 60% motile sperm groups (84.8±4.0～88.1±4.0% vs 69.1±4.0～74.2±4.0%, p<0.05). On the other hand, morphological sperm abnormality showed significantly higher in over 70% motile sperm group (10.2±2.2 vs 16.0±2.2～21.0±2.2%, p<0.05). The second study was conducted to determine the relationship between elapsed time after semen preservation on the changes of bacteria and semen quality. Semen was diluted with BTS(Beltsville Thawing Solution) extender without antibiotic for 7 days and sperm parameter and fertility were measured. Acrosomal integrity was measured by Chlortetracycline (CTC) staining. CTC patterns were uniform fluorescence over the whole head (pattern F), characteristic of incapacitated acrosome-intact spermatozoa; fluorescence-free band in the post-acrosomal region (pattern B), characteristic of capacitated acrosome-intact spermatozoa; and almost no fluorescence over the whole head except for a thin band in the equatorial segment (pattern AR), characteristic of acrosome reacted spermatozoa. Total number of bacteria was significantly increased (p<0.0001) 3 days after preservation. Sperm motility, viability, and morphological abnormality on elapsed time after preservation were lower from 5 (77.24±6.47, p<0.001) and 7 days (66.1±12.7, p<0.001) after preservation compared to 1 (15.71±7.18) and 3 days (18.39±7.22) after preservation, respectively. Sperm viability was significantly lower (53.25±35.03, p<0.0001) at 7 days after preservation. Morphological abnormality of sperm was lower (p<0.001) at 1 (15.71±7.18) and 3 (18.39±7.22) days compared to 5 (21.84±7.91) and 7 (22.59±9.93) days after preservation. Acrosomal integrity and capacitation rate (pattern F) were significantly lower (p<0.001) from 5 days after preservation. The third study was to determine the efficiency of embryo production in vitro and the relationship between sperm viability and abnormality, boar semen were prepared with different concatenations of bacteria and used for in vitro fertilization. Semen samples were prepared with 5 different levels of bacteria; 0, 3,000, 5,000, 7,000 or 10,000 cfu/ml and were used for in vitro fertilization. For sperm viability and abnormality test, semen samples were stained with fast green FCF (2%) and Eosin B (0.8%). Developmental rate of blastocyst stage was similar in groups (16.0±5.3∼18.4±5.7% in 0∼3,000 cfu/ml), but rates were significantly lower (p<0.01) in 5,000~7,000 cfu/ml group compared to control group (9.0±4.5~9.0±5.4 vs 18.4±5.7%). Bacterial contamination level of 10,000 cfu/ml group showed the lowest embryonic developmental rate (p<0.01) compared to all other groups. The bacterial contamination as much as 10,000 cfu/ml level resulted in significantly lower sperm viability (85.7±10.0%, p<0.01) compared to contaminated levels below 7,000 cfu/ml (92.4±3.6~99.3±0.3%).
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