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대장균에서 재조합 인간성장호르몬의 대량발현은 생물학적 활성이 없고 봉입체라 일컬어지는 불용성 단백질덩어리를 형성하게 된다. 최근까지 봉입체로부터 생물학적 활성을 지닌 인간성장호르몬의 회수 양을 늘리기 위한 상당한 노력들이 있었다. 여기서 단백질 정제조건을 최적화하고 봉입체의 형성을 최소화함으로써 완전한 가용성 인간성장호르몬의 제조를 위한 효과적인 실험법을 개발했다. 새로이 만들어낸 조건하에 우리는 대부분의 인간성장호르몬을 수용성 인간성장호르몬으로 얻을 수 있었다. 수용성 단백질은 일련의 ...

대장균에서 재조합 인간성장호르몬의 대량발현은 생물학적 활성이 없고 봉입체라 일컬어지는 불용성 단백질덩어리를 형성하게 된다. 최근까지 봉입체로부터 생물학적 활성을 지닌 인간성장호르몬의 회수 양을 늘리기 위한 상당한 노력들이 있었다. 여기서 단백질 정제조건을 최적화하고 봉입체의 형성을 최소화함으로써 완전한 가용성 인간성장호르몬의 제조를 위한 효과적인 실험법을 개발했다. 새로이 만들어낸 조건하에 우리는 대부분의 인간성장호르몬을 수용성 인간성장호르몬으로 얻을 수 있었다. 수용성 단백질은 일련의 크로마토그래피 과정을 통해 효과적으로 높은 순도를 가질 수 있게 정제되었다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행시간 (MALDI-TOF) 질량분석기, 원편광이색법(CD)과 다양한 분석법을 이용하여 인간성장호르몬을 분석하였다. 이러한 여러 가지의 분석법은 우리가 예상했던 분자량과 단백질의 이차구조를 가지는 높은 순도의 인간성장호르몬을 얻었다는 결론을 도출하게 한다. 정제된 인간성장호르몬의 생물학적 활성은 세포 성장 측정법을 통해 인간성장호르몬의 성장촉진 효과를 측정함으로써 확인하였다. 이러한 방법을 토대로 최종목표인 기준물질로 쓰일 수 있는 생물학적 활성을 지니며 고순도인 동위원소 표지가 된 인간성장호르몬(SI- hGH)을 대량생산하여 분석하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

High-level expression of recombinant human growth hormone (hGH) in Escherichia coli (E. coli) leads to the formation of insoluble aggregates as inclusion bodies devoid of biological activity. Until recently, significant efforts have been made to improve the recovery of active hGH from inclusion bodi...

High-level expression of recombinant human growth hormone (hGH) in Escherichia coli (E. coli) leads to the formation of insoluble aggregates as inclusion bodies devoid of biological activity. Until recently, significant efforts have been made to improve the recovery of active hGH from inclusion bodies. Here, we developed an efficient procedure for the production of completely soluble hGH by minimizing the formation of inclusion bodies and optimizing protein purification conditions. Under the newly established conditions we were able to obtain most of the total hGH in the soluble fraction. We show that the soluble protein can be efficiently purified in high yield by a series of chromatographic procedures. We analyzed the resulting hGH using various analytical techniques such as reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC), size-exclusion chromatography (SEC), matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry, and circular dichroism (CD). These multiple analyses support the conclusion that we obtained highly pure hGH with the expected molecular mass and intact secondary structure. The biological activity of purified hGH was also confirmed by evaluating its growth-promoting effect using a cell proliferation assay. Taken together, we describe a straightforward strategy for the production of completely soluble and biologically active hGH in E. coli. To use this strategy, our final goal, high-level expression and purification of stable isotope labeled recombinant hGH (SI-rhGH) having a high purity and biological activity was assessed using various analytical techniques.