키토올리고당의 효율적인 생산을 하기 위하여 Bacillus subtilis RKY3 유래 chitosanase의 정제 및 효소 특성을 조사하였다. Chitosanase를 85% ammonium sulfate를 이용한 침전과 이온 교환 수지인 DEAE-cellulose column chromatography를 통하여 정제 배율 6.9배, 총회수율은 28.6%, 그리고 비활성도는 18.5 U/mg protein으로 정제하였다. SDS-PAGE를 통하여 정제된 효소의 분자량은 21.7 kDa으로 나타났으며, ...
키토올리고당의 효율적인 생산을 하기 위하여 Bacillus subtilis RKY3 유래 chitosanase의 정제 및 효소 특성을 조사하였다. Chitosanase를 85% ammonium sulfate를 이용한 침전과 이온 교환 수지인 DEAE-cellulose column chromatography를 통하여 정제 배율 6.9배, 총회수율은 28.6%, 그리고 비활성도는 18.5 U/mg protein으로 정제하였다. SDS-PAGE를 통하여 정제된 효소의 분자량은 21.7 kDa으로 나타났으며, 효소 활성의 최적 온도는 60°C 였고, 45°C까지 열에 대한 안정성을 보였다. 그리고 효소활성의 최적 pH는 pH 6.0이었으며, pH 3.0-9.0의 넓은 범위에서 pH 안정성을 확인하였다. 효소활성에 있어서 Fe3+, Zn2+, Mg2+, Cu2+, Ca2+, Co2+, sodium dodecyl sulfate(SDS), ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)의 존재로 부분적으로 저해를 나타냈으며, 10 mmol/L Hg2+와 p-hydroxy mercuribenzoic acid는 강하게 저해하는 것을 확인하였다. 이와 반대로 10 mmol/L Mn2+는 효소활성에 있어서 촉진제로 작용함을 확인하였다. 정제된 효소는 soluble chitosan과 glycol chitosan을 가수분해 할 수 있지만, colloidal chitin, carboxymethyl cellulose, crystaline cellulose, soluble starch는 가수분해하지 못하여 키토산에만 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있었다. 그리고 가수분해산물과 가수분해 패턴을 확인하기 위하여 thin-layer chromatography(TLC)와 반응 중의 키토산의 점도 변화를 확인하였고, Bacillus subtilis RKY3 유래 chitosanase는 최종 반응산물로 chitobiose, chitotriose, 그리고 chitotetraose의 혼합물을 만들어 내며, endo-splitting 방식의 기작을 보이는 효소임을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 Bacillus subtilis RKY3 유래 chitosanase는 비교적 낮은 분자량을 가지는 새로운 키토산 분해효소이며, 가용성 키토산을 분해하여 생체기능적 키토올리고당을 높은 수준으로 생산할 수 있는 유용한 효소임을 알 수 있었다.
키토올리고당의 효율적인 생산을 하기 위하여 Bacillus subtilis RKY3 유래 chitosanase의 정제 및 효소 특성을 조사하였다. Chitosanase를 85% ammonium sulfate를 이용한 침전과 이온 교환 수지인 DEAE-cellulose column chromatography를 통하여 정제 배율 6.9배, 총회수율은 28.6%, 그리고 비활성도는 18.5 U/mg protein으로 정제하였다. SDS-PAGE를 통하여 정제된 효소의 분자량은 21.7 kDa으로 나타났으며, 효소 활성의 최적 온도는 60°C 였고, 45°C까지 열에 대한 안정성을 보였다. 그리고 효소활성의 최적 pH는 pH 6.0이었으며, pH 3.0-9.0의 넓은 범위에서 pH 안정성을 확인하였다. 효소활성에 있어서 Fe3+, Zn2+, Mg2+, Cu2+, Ca2+, Co2+, sodium dodecyl sulfate(SDS), ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)의 존재로 부분적으로 저해를 나타냈으며, 10 mmol/L Hg2+와 p-hydroxy mercuribenzoic acid는 강하게 저해하는 것을 확인하였다. 이와 반대로 10 mmol/L Mn2+는 효소활성에 있어서 촉진제로 작용함을 확인하였다. 정제된 효소는 soluble chitosan과 glycol chitosan을 가수분해 할 수 있지만, colloidal chitin, carboxymethyl cellulose, crystaline cellulose, soluble starch는 가수분해하지 못하여 키토산에만 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있었다. 그리고 가수분해산물과 가수분해 패턴을 확인하기 위하여 thin-layer chromatography(TLC)와 반응 중의 키토산의 점도 변화를 확인하였고, Bacillus subtilis RKY3 유래 chitosanase는 최종 반응산물로 chitobiose, chitotriose, 그리고 chitotetraose의 혼합물을 만들어 내며, endo-splitting 방식의 기작을 보이는 효소임을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 Bacillus subtilis RKY3 유래 chitosanase는 비교적 낮은 분자량을 가지는 새로운 키토산 분해효소이며, 가용성 키토산을 분해하여 생체기능적 키토올리고당을 높은 수준으로 생산할 수 있는 유용한 효소임을 알 수 있었다.
Purification and enzymatic properties of a chitosanase (E.C. 3.2.1.132) from Bacillus subtilis RKY3 have been investigated to produce a chitooligo-saccharide. The enzyme has been purified by using 85% ammonium sulfate precipitation and DEAE-cellulose column chromatography, with a recovery of 28.6% a...
Purification and enzymatic properties of a chitosanase (E.C. 3.2.1.132) from Bacillus subtilis RKY3 have been investigated to produce a chitooligo-saccharide. The enzyme has been purified by using 85% ammonium sulfate precipitation and DEAE-cellulose column chromatography, with a recovery of 28.6% and specific activity of 18.5 U/mg protein. Molecular weight of the purified chitosanase was estimated to be approximately 21.7 kDa by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The highest chitosanase activity was exhibited to be at 60°C and pH 6.0. Chitosanase was stable at pH 3.0-9.0 and under 45°C. Enzyme activity was inhibited partially by some metal ions and additives, such as Fe3+, Zn2+, Mg2+, Cu2+, Ca2+, Co2+, sodium dodecyl sulfate and ethylenediamine tetraacetic acid. Chitosanase was severely inhibited by Hg2+(10 mmol/L) and p-hydroxymercuribenzoic acid. In contrast, its activity was enhanced by the addition of Mn2+(10 mmol/L). The enzyme was capable of hydrolyzing soluble chitosan and glycol chitosan, but it did not liberate colloidal chitin, carboxymethyl cellulose, crystalline cellulose, and soluble starch. The purified enzyme showed an endo-splitting type of activity, and end-products such as chitobiose, chitotriose, and chitotetraose were confirmed by thin-layer chromatography and viscosity variation. As a result, the chitosanase produced by Bacillus subtilis RKY3 was a novel chitosan hydrolyzing enzyme with relatively low molecular weight, which might be considered as a valuable enzyme for chitosan hydrolysis because it could hydrolyze soluble chitosan into a biofunctional chitooligosaccharide at a high level.
Purification and enzymatic properties of a chitosanase (E.C. 3.2.1.132) from Bacillus subtilis RKY3 have been investigated to produce a chitooligo-saccharide. The enzyme has been purified by using 85% ammonium sulfate precipitation and DEAE-cellulose column chromatography, with a recovery of 28.6% and specific activity of 18.5 U/mg protein. Molecular weight of the purified chitosanase was estimated to be approximately 21.7 kDa by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The highest chitosanase activity was exhibited to be at 60°C and pH 6.0. Chitosanase was stable at pH 3.0-9.0 and under 45°C. Enzyme activity was inhibited partially by some metal ions and additives, such as Fe3+, Zn2+, Mg2+, Cu2+, Ca2+, Co2+, sodium dodecyl sulfate and ethylenediamine tetraacetic acid. Chitosanase was severely inhibited by Hg2+(10 mmol/L) and p-hydroxymercuribenzoic acid. In contrast, its activity was enhanced by the addition of Mn2+(10 mmol/L). The enzyme was capable of hydrolyzing soluble chitosan and glycol chitosan, but it did not liberate colloidal chitin, carboxymethyl cellulose, crystalline cellulose, and soluble starch. The purified enzyme showed an endo-splitting type of activity, and end-products such as chitobiose, chitotriose, and chitotetraose were confirmed by thin-layer chromatography and viscosity variation. As a result, the chitosanase produced by Bacillus subtilis RKY3 was a novel chitosan hydrolyzing enzyme with relatively low molecular weight, which might be considered as a valuable enzyme for chitosan hydrolysis because it could hydrolyze soluble chitosan into a biofunctional chitooligosaccharide at a high level.
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