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어란의 종동정은 어류 산란생태 연구의 시작이다. 종동정 기반의 어란 분포 정보는 어류의 산란장과 산란시기 등의 산란생태를 이해하는데 매우 중요하기 때문이다. 이러한 중요성에도 불구하고 알려진 어란 분포 정보는 적다. 형태형질 기반의 종동정이 매우 어렵기 때문이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 mtDNA 분자마커를 사용했다. 종동정의 기준은 mtDNA의 종내/종간 유전적 차이에 근거한다. mtDNA를 이용한 어란의 종동정 유용성 검증에 필요한 표본을 남해 연근해(2011-2012년), ...

어란의 종동정은 어류 산란생태 연구의 시작이다. 종동정 기반의 어란 분포 정보는 어류의 산란장과 산란시기 등의 산란생태를 이해하는데 매우 중요하기 때문이다. 이러한 중요성에도 불구하고 알려진 어란 분포 정보는 적다. 형태형질 기반의 종동정이 매우 어렵기 때문이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 mtDNA 분자마커를 사용했다. 종동정의 기준은 mtDNA의 종내/종간 유전적 차이에 근거한다. mtDNA를 이용한 어란의 종동정 유용성 검증에 필요한 표본을 남해 연근해(2011-2012년), 북서태평양(2012년), 여수(2008-2010년), 통영(2012년)에서 채집했다. 어란 종동정에 사용한 분자마커는 16S, control region (CR), COI의 세 종류였다. 종 분석에 필요한 분자마커의 염기서열을 단일 어란 시료는 Sanger sequencing (SS)으로, 혼성 어란 시료는 Next-Generation sequencing (차세대염기서열분석법, NGS)으로 획득하였다. SS로 얻은 염기서열을 참조 염기서열과 종간 유사도를 비교하여 종을 결정하였다. 혼성 어란에서 NGS로 얻은 대량의 유전자 염기서열 분석을 위해 어류의 16S 유전자의 참조 염기서열(reference DB)을 구축하였다. 이 참조 염기서열과 비교하여 phylotype 기반의 OTU를 생산하였다. 유사분류군과의 Maximum likelihood (ML) tree를 작성하여 OTU를 종으로 결정했다. NGS 분석의 종 탐지능력과 재현성 분석을 위해 SS 분석 시료를 NGS로 재분석하였다. NGS 분석시 필요한 어란 표본 수와 유전자 염기서열 read 개수의 최소 조건을 알아보기 위해 어란의 표본 수와 종수, 유전자 염기서열 read 개수와 종수에 대한 rarefaction curve를 분석했다. SS로 분석된 어란의 분류군 수는 총 70개였다. 이 중 44개 분류군을 종 수준으로 분석했다(기타 해양 무척추 동물의 알 2종 제외). 세 종류의 분자마커는 분류군에 따라 분해능에 차이가 있다. 16S로 종 분석이 불가능한 분류군 중 다랑어류(Thunnus spp.)는 CR로 새다래류(Bramidae spp.)는 COI으로 종 수준의 분석이 가능했다. NGS로 분석된 어란은 총 38개 분류군이었다. 이 중 26개 분류군을 종 수준으로 분석하였다. 혼성 어란의 종동정에 NGS를 적용하기 위해 NGS의 종 탐지능력, 재현성, 최소 분석 조건을 확인했다. SS로 분석한 20 종의 시료를 NGS로 분석한 결과 누적종수는 총 18종으로 평균 16종(± 1.50)을 탐지하였다. NGS의 재현성은 반복 분석된 샘플 간 종조성의 유의한 차이가 없는 것으로 확인했다(Kruskal-Wallis 순위합검정, p > 0.05). Rarefaction curve를 이용한 NGS의 최소 어란 분석 개체수는 약 300개, 최소 염기서열 read 개수는 어란 100개체당 약 200개였다. 분석된 어란은 종에 따라 분포해역에 차이가 있었다. 멸치(Engraulis japonicus), 미역치과(Aploactinidae sp.), 첨치과(Ophiididae sp.) 등은 연근해에서, 가다랑어(Katsuwonus pelamis), 태평양멸치(Encrasicholina punctifer), Vinciguerria nimbaria 등은 북서태평양에서, 물치다래류(Auxis sp.)와 만새기(Corypahena hippurus)는 연근해에서 대양까지였다. 어란의 종조성 자료에 의한 여수해역에서 우점 산란종은 멸치(E. japonicus), 주둥치(Nuchequula nuchalis), 청보리멸(Silago japonica), 미역치(Paracentropogon rubripinnis) 등이다. 주산란시기는 6월과 7월이지만 종마다 산란시기의 시작은 차이가 났다. 멸치는 5월부터, 주둥치와 청보리멸은 6월부터, 미역치는 7월부터 산란하기 시작했다. mtDNA 분자마커 기반의 DNA sequencing은 어란을 종 수준까지 동정하는데 매우 유용한 방법이다. 형태형질 정보가 없는 어란도 유전자 정보만으로 종 수준의 분석이 가능했다. 종 수준의 분석률을 높이기 위해서는 종간/종내 유전적 변이를 고려한 분자마커의 선택이 필요하다. NGS 분석시 분석의 정밀도를 높이기 위해서는 참조 유전자 염기서열 DB 구축이 필요하다. NGS를 이용한 혼성 어란의 종동정은 어류의 종별 산란특성 정보 기반의 금어기 설정, 어장 보호 해역 설정, 어류 생태 기반의 새로운 해양환경 변화 지표 개발에 기여할 것이다.

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ABSTRACT Species identification of massive fish eggs and understanding their distribution using Sanger and Next-Generation Sequencing (SS/NGS) Species identification of fish egg is the beginning of the study on fish spawning ecology. Distribution based on species identification of fish eggs is extre...

ABSTRACT Species identification of massive fish eggs and understanding their distribution using Sanger and Next-Generation Sequencing (SS/NGS) Species identification of fish egg is the beginning of the study on fish spawning ecology. Distribution based on species identification of fish eggs is extremely important to understand spawning ecology such as spawning ground and spawning time. Despite of this importance, there are few studies on fish egg distribution. Because species identification of fish egg is very difficult using morphology. To solve this problem mtDNA molecular markers were applied for species identification. Species identification is based on intra/inter specific genetic differences of mtDNA among species. For verification of usefulness to species identification of fish egg using mtDNA sequencing, egg specimens were collected in southern sea offshore of Korea (2011-2012), the northwestern Pacific (2012), Yeosu (2008-2010), and Tongyeong (2012). Molecular markers used for species identification of fish eggs were three types of 16S, control region (CR), and COI. The sequences of moleucular markers were obtained in Sanger sequencing (SS) for single egg specimens and in Next-Generation sequencing (NGS) for mixed egg specimens. The sequence obtained from SS was determined to species by comparing the degree of similarity with reference sequence. For analysis of massive sequences obtained from NGS, a reference sequence (reference DB) was established with 16S gene sequences of fish. Compared to this reference sequence, phylotype based OTUs were produced. The OTUs were determined to species by constructing maximum likelihood (ML) tree with similar taxa’s sequence. For analysing species detection capability and reproducibility of NGS, the SS sample was re-analyzed by NGS. To find out the minimum conditions to numbers of egg specimen and sequence read required for NGS analysis, the rarefaction curves were plotted. The number of taxa analyzed by the SS was total of 70. Of 70, 44 taxa was identified to species level except for two species of other invertebrate’s egg. The resolution of three molecular markers was different depending on taxa. Of species impossible to identify by 16S, Thunnus spp. could be identified to species level using CR. Bramidae spp. were identified using COI. Taxa number of fish egg identified using NGS was 38. Of them, 26 taxa were identified to species level. For application of NGS to species identification of mixed fish eggs, species detection capability and reproducibility of NGS, and the minimum analysis conditions were confirmed. Of 20 species analyzed with SS, total 18 species were detected using NGS. Reproducibility of NGS was confirmed by no significant difference in species composition among samples analysed repeatedly using NGS (Kruskal-Wallis rank sum test, p > 0.05). Minimum conditions of NGS analysis resulted from rarefaction curve were 300 fish eggs and 200 sequence reads per 100 egg specimens. Fish eggs identified to species were distributed differently depending on the species. Engraulis japonicus, Aploactinidae sp., Ophiididae sp. were in southern sea offshore of Korea. Skipjack tuna (Katsuwonus pelamis), Encrasicholina punctifer, Vinciguerria nimbaria were in the norhtwestern Pacific. Auxis sp. and Corypahena hippurus were in both areas. Main spawning species revealed by species composition of fish eggs collected in Yeosu were Engraulis japonicus, Nuchequula nuchalis, Silago japonica, and Paracentropogon rubripinnis. The main spawning time was during the summer period (June-July). However, each spawning time was clearly different. E. japonicus began spawning from May, N. equula and S. japonica did from June, and P. rubripinnis did from July. DNA sequencing based on mtDNA molecular markers is a very useful method for identification of fish eggs to the species level. Species identification is possible using only sequence information, although egg morphology has not been reported. To increase success rate of analysis, it was considered inter/intra genetic variation of gene or cumulative reference sequence DB of molecular marker. When analysing NGS, it was required to build the reference sequence DB. Species identification of mixed fish eggs using NGS will contribute to setting the closed season for fishery, establishing the fisheries protection area, and developing new indicators of the marine environmental change based on fish ecology.* A thesis submitted to committee of the University of Science and Technology in a partial fulfillment of the requirement for the degree of Doctor of Philosophy in Science(Major: Marine Biology) conferred in February 2015.

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