[학위논문]복분자 주정 추출물의 항염증 활성 대사산물 동정 Metabolomic Screening of Anti-Inflammatory Compounds in Ethanol (Spirit) Extracts of Korean Black Raspberry (Rubus coreanus Miquel)원문보기
복분자(장미과, Rubus coreanus Miquel)는 우리 나라 전라도 지역에서 주로 재배되고 있는 Black raspberry이며, 섬유소와 비타민, 무기질이 풍부하고 특히, Polyphenol의 Flavonoids 계열이 다량 함유되어 있다고 알려져 있다. 복분자를 대표하는 검붉은 색은 Flavonoids 계열의 Anthocyanin류에 기인한다. Anthocyanin은 기능성 색소로서 현재 각광 받고 있는 phytochemical이며, ...
복분자(장미과, Rubus coreanus Miquel)는 우리 나라 전라도 지역에서 주로 재배되고 있는 Black raspberry이며, 섬유소와 비타민, 무기질이 풍부하고 특히, Polyphenol의 Flavonoids 계열이 다량 함유되어 있다고 알려져 있다. 복분자를 대표하는 검붉은 색은 Flavonoids 계열의 Anthocyanin류에 기인한다. Anthocyanin은 기능성 색소로서 현재 각광 받고 있는 phytochemical이며, 항산화, 항암, 항염증, 항노화 등 다양한 생리활성 효과가 있다고 알려져 있다. 하지만 현재 복분자 생리활성과 Metabolomics를 이용한 함유 성분 분석의 연관성에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 식용 가능한 주정 (Ethanol, Spirit) 을 사용하여 추출한 복분자 추출물을 이용하여 in vitro와 in vivo상에서의 항염증 효과 확인과 항염증 효과를 나타내는 성분 동정을 통해 생리활성을 갖는 기능적인 식용 색소체로의 이용가능성을 예측하며 연구를 수행하였다. 식용 가능한 주정을 농도별 (D.W., 50%, 75%, 95%) 로 사용하여 복분자에 함유되어 있는 기능성 성분을 추출하였다. 추출물들은 전반적으로 붉은 계열의 색을 띠었으며 50% 주정 추출물에서 가장 높은 밝기와 적색도를 보였다. 4개의 추출물을 이용하여 in vitro 상에서 항염증 효과를 확인하는 실험을 진행하였다. Lipopolysaccharide (LPS) 로 염증을 유발시킨 RAW 264.7 세포를 사용하여 복분자 주정 추출물을 처리하였다. 염증 marker인 Inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 Cyclooxgenase-2 (COX-2)의 저해 활성을 측정을 통해 항염증 효과를 확인하였고, 4개의 추출물 중 50% 주정 추출물이 iNOS의 발현을 특이적으로 저해하였고 COX-2에서는 염증을 저해하는 효과를 보이지 않았다. 또한, Male ICR mice를 이용한 in vivo 상에서 항염증 효과를 확인하는 실험을 진행하였다, 1.5% Dextran sulfate sodium (DSS)로 궤양성 대장염을 유발시킨 mice에 복분자 주정 추출물을 처리하였다. 그 결과, 50% 주정 추출물에서 유의적으로 장 길이를 회복시키는 것을 통해 항염증 조절 효과를 확인하였다. 장에서 단백질을 추출하여 염증 관련 marker인 iNOS와 COX-2의 발현 조절 활성을 분석하였고, iNOS의 경우 모든 복분자 주정 추출물에서 염증을 저해하는 효과를 보였으며 COX-2에서는 50% 주정 추출물에서 다른 추출물에 비해 항염증 효과를 보이는 것으로 나타났다. iNOS의 염증성 cytokine의 발현 조절 상위 신호전달 경로를 확인하기 위하여 Nuclear factor κB (NF-κB) 신호전달 경로의 대표적인 marker인 Inhibitory κB (IκB-α)가 분해되는 정도와 Mitogen-activated protein kinase (MAPK) 신호전달 경로의 대표적인 marker인 Extracellular signal-regulated kinase (ERK)와 cytokine과 같은 스트레에 반응하는 protein kinase인 c-Jun N-terminal kinases (JNK)의 활성 정도를 분석하였다. 그 결과, 50% 주정 추출물에서 유의적으로 IκB-α의 분해를 막는 것을 확인하였고, ERK와 JNK의 활성화를 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 복분자 주정 추출물을 먹인 동물모델에서 DSS에 의해 야기된 염증에 의하여 염증성 cytokine (TNF-α, IL-6, IL-1β) 의 조절 효과를 분석하였다. 그 결과, Tumor necrosis factor-α (TNF-α)는 50% 주정 추출물을 먹인 집단에서, Interleukin-6 (IL-6)와 Interleukin-1β (IL-1β)는 50%, 75% 주정 추출물을 먹인 집단에서 염증 생성을 저해하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 50% 주정 추출물에 함유된 항염증 효과에 영향을 미치는 대사체를 LC-ESI-Ion trap-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 다변량 통계분석인 Principal component analysis (PCA), Orthogonal partial least squared-discriminant analysis (OPLS-DA)를 실시하여 50% 주정 추출물과 나머지 D.W. 추출물, 75% 주정 추출물, 95% 주정 추출물과의 비교를 통해 두 추출물간 유의적인 차이를 보이는 대사체들을 동정하였다. 그 결과, 50% 주정 추출물은 나머지 추출물에 비해 Cyanidin-3-glucoside가 유의성 있는 성분으로 검출되었다. 따라서 복분자 주정 추출물에 함유되어 있는 Cyanidin-3-glucoside를 HPLC를 이용하여 정량적 분석을 하였고, 50% 주정 추출물에 Cyanidin-3-glucoside가 가장 많이 함유되어 있음을 확인하였다. 50% 주정 추출물과 동일한 Cyanidin-3-glucoside의 양을 RAW 264.7 세포에 처리하여 LPS에 의해 유도된 iNOS 저해 효과를 확인해 본 결과, 비슷한 양상으로 염증이 저해되는 것을 확인하였다. 이로써 Cyanidin-3-glucoside가 50% 주정 추출물의 항염증 효과에 영향을 미치는 물질로 사료된다. 본 연구는 국내산 토종 품종인 복분자의 기능적인 식용 성분의 이용과 산업화에 있어 기초 자료로 사용될 수 있다.
복분자(장미과, Rubus coreanus Miquel)는 우리 나라 전라도 지역에서 주로 재배되고 있는 Black raspberry이며, 섬유소와 비타민, 무기질이 풍부하고 특히, Polyphenol의 Flavonoids 계열이 다량 함유되어 있다고 알려져 있다. 복분자를 대표하는 검붉은 색은 Flavonoids 계열의 Anthocyanin류에 기인한다. Anthocyanin은 기능성 색소로서 현재 각광 받고 있는 phytochemical이며, 항산화, 항암, 항염증, 항노화 등 다양한 생리활성 효과가 있다고 알려져 있다. 하지만 현재 복분자 생리활성과 Metabolomics를 이용한 함유 성분 분석의 연관성에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서, 본 연구에서는 식용 가능한 주정 (Ethanol, Spirit) 을 사용하여 추출한 복분자 추출물을 이용하여 in vitro와 in vivo상에서의 항염증 효과 확인과 항염증 효과를 나타내는 성분 동정을 통해 생리활성을 갖는 기능적인 식용 색소체로의 이용가능성을 예측하며 연구를 수행하였다. 식용 가능한 주정을 농도별 (D.W., 50%, 75%, 95%) 로 사용하여 복분자에 함유되어 있는 기능성 성분을 추출하였다. 추출물들은 전반적으로 붉은 계열의 색을 띠었으며 50% 주정 추출물에서 가장 높은 밝기와 적색도를 보였다. 4개의 추출물을 이용하여 in vitro 상에서 항염증 효과를 확인하는 실험을 진행하였다. Lipopolysaccharide (LPS) 로 염증을 유발시킨 RAW 264.7 세포를 사용하여 복분자 주정 추출물을 처리하였다. 염증 marker인 Inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 Cyclooxgenase-2 (COX-2)의 저해 활성을 측정을 통해 항염증 효과를 확인하였고, 4개의 추출물 중 50% 주정 추출물이 iNOS의 발현을 특이적으로 저해하였고 COX-2에서는 염증을 저해하는 효과를 보이지 않았다. 또한, Male ICR mice를 이용한 in vivo 상에서 항염증 효과를 확인하는 실험을 진행하였다, 1.5% Dextran sulfate sodium (DSS)로 궤양성 대장염을 유발시킨 mice에 복분자 주정 추출물을 처리하였다. 그 결과, 50% 주정 추출물에서 유의적으로 장 길이를 회복시키는 것을 통해 항염증 조절 효과를 확인하였다. 장에서 단백질을 추출하여 염증 관련 marker인 iNOS와 COX-2의 발현 조절 활성을 분석하였고, iNOS의 경우 모든 복분자 주정 추출물에서 염증을 저해하는 효과를 보였으며 COX-2에서는 50% 주정 추출물에서 다른 추출물에 비해 항염증 효과를 보이는 것으로 나타났다. iNOS의 염증성 cytokine의 발현 조절 상위 신호전달 경로를 확인하기 위하여 Nuclear factor κB (NF-κB) 신호전달 경로의 대표적인 marker인 Inhibitory κB (IκB-α)가 분해되는 정도와 Mitogen-activated protein kinase (MAPK) 신호전달 경로의 대표적인 marker인 Extracellular signal-regulated kinase (ERK)와 cytokine과 같은 스트레에 반응하는 protein kinase인 c-Jun N-terminal kinases (JNK)의 활성 정도를 분석하였다. 그 결과, 50% 주정 추출물에서 유의적으로 IκB-α의 분해를 막는 것을 확인하였고, ERK와 JNK의 활성화를 억제하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 복분자 주정 추출물을 먹인 동물모델에서 DSS에 의해 야기된 염증에 의하여 염증성 cytokine (TNF-α, IL-6, IL-1β) 의 조절 효과를 분석하였다. 그 결과, Tumor necrosis factor-α (TNF-α)는 50% 주정 추출물을 먹인 집단에서, Interleukin-6 (IL-6)와 Interleukin-1β (IL-1β)는 50%, 75% 주정 추출물을 먹인 집단에서 염증 생성을 저해하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 50% 주정 추출물에 함유된 항염증 효과에 영향을 미치는 대사체를 LC-ESI-Ion trap-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 다변량 통계분석인 Principal component analysis (PCA), Orthogonal partial least squared-discriminant analysis (OPLS-DA)를 실시하여 50% 주정 추출물과 나머지 D.W. 추출물, 75% 주정 추출물, 95% 주정 추출물과의 비교를 통해 두 추출물간 유의적인 차이를 보이는 대사체들을 동정하였다. 그 결과, 50% 주정 추출물은 나머지 추출물에 비해 Cyanidin-3-glucoside가 유의성 있는 성분으로 검출되었다. 따라서 복분자 주정 추출물에 함유되어 있는 Cyanidin-3-glucoside를 HPLC를 이용하여 정량적 분석을 하였고, 50% 주정 추출물에 Cyanidin-3-glucoside가 가장 많이 함유되어 있음을 확인하였다. 50% 주정 추출물과 동일한 Cyanidin-3-glucoside의 양을 RAW 264.7 세포에 처리하여 LPS에 의해 유도된 iNOS 저해 효과를 확인해 본 결과, 비슷한 양상으로 염증이 저해되는 것을 확인하였다. 이로써 Cyanidin-3-glucoside가 50% 주정 추출물의 항염증 효과에 영향을 미치는 물질로 사료된다. 본 연구는 국내산 토종 품종인 복분자의 기능적인 식용 성분의 이용과 산업화에 있어 기초 자료로 사용될 수 있다.
Korean black raspberry (Rubus coreanus Miquel) of family Rosaceae was mostly cultivated in Jeolla-do, Korea and known for its plentiful vitamins, minerals, fiber and especially polyphenols. Ethanol (Spirit) extracts (D.W., 50%, 75%, 95%) were prepared and their anti-inflammatory activities were eval...
Korean black raspberry (Rubus coreanus Miquel) of family Rosaceae was mostly cultivated in Jeolla-do, Korea and known for its plentiful vitamins, minerals, fiber and especially polyphenols. Ethanol (Spirit) extracts (D.W., 50%, 75%, 95%) were prepared and their anti-inflammatory activities were evaluated using lipopolysaccharide (LPS) induced RAW 264.7 macrophage cells. 50% ethanol extract showed the highest inhibitory effect in vitro by down-regulating inducible nitric oxide synthase (iNOS) level. It was also conducted that the anti-inflammatory activity was confirmed using male ICR mice in vivo. Korean black raspberry ethanol extracts treated with 1.5% dextran sulfate sodium (DSS) induced mice. As a result, the anti-inflammatory activity was confirmed through the recovered length of colon significantly in 50% ethanol extract. In protein level, Korean black raspberry ethanol extracts had the inhibitory effects in all extracts on iNOS level and especially 50% ethanol extract had higher inhibitory effect among 4 extracts on COX-2 expression. Extract of 50% ethanol also controlled inhibitory κB (IκB-α) that function to inhibit the nuclear factor κB (NF-κB) transcription factor, extracellular signal-regulated kinases (ERK) which were classical mitogen-activated protein (MAP) kinases, and c-jun N-terminal kinases (JNK) that were responsive to stress stimuli, such as cytokines. The protein expression of DSS-induced interleukin-6 (IL-6) and interleukin-1β (IL-1β) were down-regulated by 50% ethanol extract and 75% ethanol extract. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) was down-regulated by 50% ethanol extract. To screen anti-inflammatory metabolomes of 50% ethanol extract, data were analyzed using LC-ESI-Ion trap-MS/MS and multivariate statistical analysis such as principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squared-discriminant analysis (OPLS-DA). Consequently, cyanidin-3-glucoside was found significantly higher in 50% ethanol extract compared to other concentrations. On the basis of these results, we quantified cyanidin-3-glucoside in Korean black raspberry ethanol extracts, in which 50% ethanol extract was observed much higher amount than the others. I treated with quantified amount of 50% ethanol extract and standard of cyanidin-3-glucoside in RAW 264.7 macrophage cells to compare effects of anti-inflammation. A similar pattern between standard of cyanidin-3-glucoside and 50% ethanol extract was found on the anti-inflammatory effect. The present results suggest that the anti-inflammatory effect of 50% ethanol extract was due to cyanidin-3-glucoside. This study will be a useful basement for the application of Korean black raspberry as nutraceuticals.
Korean black raspberry (Rubus coreanus Miquel) of family Rosaceae was mostly cultivated in Jeolla-do, Korea and known for its plentiful vitamins, minerals, fiber and especially polyphenols. Ethanol (Spirit) extracts (D.W., 50%, 75%, 95%) were prepared and their anti-inflammatory activities were evaluated using lipopolysaccharide (LPS) induced RAW 264.7 macrophage cells. 50% ethanol extract showed the highest inhibitory effect in vitro by down-regulating inducible nitric oxide synthase (iNOS) level. It was also conducted that the anti-inflammatory activity was confirmed using male ICR mice in vivo. Korean black raspberry ethanol extracts treated with 1.5% dextran sulfate sodium (DSS) induced mice. As a result, the anti-inflammatory activity was confirmed through the recovered length of colon significantly in 50% ethanol extract. In protein level, Korean black raspberry ethanol extracts had the inhibitory effects in all extracts on iNOS level and especially 50% ethanol extract had higher inhibitory effect among 4 extracts on COX-2 expression. Extract of 50% ethanol also controlled inhibitory κB (IκB-α) that function to inhibit the nuclear factor κB (NF-κB) transcription factor, extracellular signal-regulated kinases (ERK) which were classical mitogen-activated protein (MAP) kinases, and c-jun N-terminal kinases (JNK) that were responsive to stress stimuli, such as cytokines. The protein expression of DSS-induced interleukin-6 (IL-6) and interleukin-1β (IL-1β) were down-regulated by 50% ethanol extract and 75% ethanol extract. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) was down-regulated by 50% ethanol extract. To screen anti-inflammatory metabolomes of 50% ethanol extract, data were analyzed using LC-ESI-Ion trap-MS/MS and multivariate statistical analysis such as principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squared-discriminant analysis (OPLS-DA). Consequently, cyanidin-3-glucoside was found significantly higher in 50% ethanol extract compared to other concentrations. On the basis of these results, we quantified cyanidin-3-glucoside in Korean black raspberry ethanol extracts, in which 50% ethanol extract was observed much higher amount than the others. I treated with quantified amount of 50% ethanol extract and standard of cyanidin-3-glucoside in RAW 264.7 macrophage cells to compare effects of anti-inflammation. A similar pattern between standard of cyanidin-3-glucoside and 50% ethanol extract was found on the anti-inflammatory effect. The present results suggest that the anti-inflammatory effect of 50% ethanol extract was due to cyanidin-3-glucoside. This study will be a useful basement for the application of Korean black raspberry as nutraceuticals.
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