Thermococcus onnurineus NA1 균주에서 분리된 TonLon은 LonB 그룹에 포함되며 샤페론의 기능을 가지고 있는 AAA+ 모듈과 프로테아제의 기능을 가지고 있는 프로테아제 도메인을 포함하는 두 가지 활성을 갖는 ATP-dependent 단백질이다. LonA 그룹에 포함된 EcLon은 ATP-dependent 단백질로 가장 먼저 보고되었고, 그 이후 일곱 종의 ATP-dependent 단백질들이 보고되었다. 하지만, 이들 단백질은의 구조 규명은 쉽지 않아 30년간 전체 구조가 밝혀지지 않았다. 이번 논문은 LonB 그룹에 포함된 TonLon의 구조 규명 및 분석을 바탕으로 단백질 활성에 관여하는 아미노산들의 돌연변이형을 만들어 TonLon의 메커니즘을 규명하고자 하였다. 단백질의 ...
Thermococcus onnurineus NA1 균주에서 분리된 TonLon은 LonB 그룹에 포함되며 샤페론의 기능을 가지고 있는 AAA+ 모듈과 프로테아제의 기능을 가지고 있는 프로테아제 도메인을 포함하는 두 가지 활성을 갖는 ATP-dependent 단백질이다. LonA 그룹에 포함된 EcLon은 ATP-dependent 단백질로 가장 먼저 보고되었고, 그 이후 일곱 종의 ATP-dependent 단백질들이 보고되었다. 하지만, 이들 단백질은의 구조 규명은 쉽지 않아 30년간 전체 구조가 밝혀지지 않았다. 이번 논문은 LonB 그룹에 포함된 TonLon의 구조 규명 및 분석을 바탕으로 단백질 활성에 관여하는 아미노산들의 돌연변이형을 만들어 TonLon의 메커니즘을 규명하고자 하였다. 단백질의 용해도를 높이기 위해 AAA+ 모듈의 transmembrane 결합 부분을 제거한 TonLon 뮤턴트(TonLon△TM)를 만들었고, TonLon△TM은 단백질 정제 과정 중 단백질의 크기별로 분리하는 GFC 컬럼에서 분자가 2개와 6개로 존재하는 것을 확인 하였으며, 기존 BtLon이 6개의 분자로 존재하여 활성을 갖는다고 보고되었는데, TonLon△TM 또한 6개의 분자들로 구성되었기 때문에 기존에 보고와 일치되는 결과를 확인 할 수 있었다. 하지만 TonLon은 스스로를 분해하는 특성을 갖고 있어 결정화 하는 데에 문제가 발생하여, 프로테아제 활성을 가지는 2개의 아미노산을 치환시켰다. 프로테아제 활성이 억제된 뮤턴트로 2.0Å으로 회절 데이터를 얻어 구조를 규명을 할 수 있었다. TonLon의 구조는 AAA+ 모듈과 프로테아제 도메인이 H18에 의해 연결된 하나의 분자로 존재하였다. 하나의 유닛안에 ADP 바인딩 상태가 다른 헤테로 다이머가 존재하였고 비대칭유닛으로 확인한 결과 다이머 3개가 하나의 헥사머를 이루고 있었다. TonLon의 메커니즘을 규명하고자 기질이 들어가는 입구의 insertion 부위, ATP 바인딩 부위, 프로테아제 활성을 갖는 부위에서 각 부위에서 활성에 중요한 아미노산을 치환하여 활성여부를 확인하였고, 그 결과 3 부위 모두 프로테아제 활성에 중요한 역할을 갖는 것이 규명되었다.
Thermococcus onnurineus NA1 균주에서 분리된 TonLon은 LonB 그룹에 포함되며 샤페론의 기능을 가지고 있는 AAA+ 모듈과 프로테아제의 기능을 가지고 있는 프로테아제 도메인을 포함하는 두 가지 활성을 갖는 ATP-dependent 단백질이다. LonA 그룹에 포함된 EcLon은 ATP-dependent 단백질로 가장 먼저 보고되었고, 그 이후 일곱 종의 ATP-dependent 단백질들이 보고되었다. 하지만, 이들 단백질은의 구조 규명은 쉽지 않아 30년간 전체 구조가 밝혀지지 않았다. 이번 논문은 LonB 그룹에 포함된 TonLon의 구조 규명 및 분석을 바탕으로 단백질 활성에 관여하는 아미노산들의 돌연변이형을 만들어 TonLon의 메커니즘을 규명하고자 하였다. 단백질의 용해도를 높이기 위해 AAA+ 모듈의 transmembrane 결합 부분을 제거한 TonLon 뮤턴트(TonLon△TM)를 만들었고, TonLon△TM은 단백질 정제 과정 중 단백질의 크기별로 분리하는 GFC 컬럼에서 분자가 2개와 6개로 존재하는 것을 확인 하였으며, 기존 BtLon이 6개의 분자로 존재하여 활성을 갖는다고 보고되었는데, TonLon△TM 또한 6개의 분자들로 구성되었기 때문에 기존에 보고와 일치되는 결과를 확인 할 수 있었다. 하지만 TonLon은 스스로를 분해하는 특성을 갖고 있어 결정화 하는 데에 문제가 발생하여, 프로테아제 활성을 가지는 2개의 아미노산을 치환시켰다. 프로테아제 활성이 억제된 뮤턴트로 2.0Å으로 회절 데이터를 얻어 구조를 규명을 할 수 있었다. TonLon의 구조는 AAA+ 모듈과 프로테아제 도메인이 H18에 의해 연결된 하나의 분자로 존재하였다. 하나의 유닛안에 ADP 바인딩 상태가 다른 헤테로 다이머가 존재하였고 비대칭유닛으로 확인한 결과 다이머 3개가 하나의 헥사머를 이루고 있었다. TonLon의 메커니즘을 규명하고자 기질이 들어가는 입구의 insertion 부위, ATP 바인딩 부위, 프로테아제 활성을 갖는 부위에서 각 부위에서 활성에 중요한 아미노산을 치환하여 활성여부를 확인하였고, 그 결과 3 부위 모두 프로테아제 활성에 중요한 역할을 갖는 것이 규명되었다.
Lon proteases are distributed in all kingdoms of life and are required for survival of cells under stress. Lon is an oligomeric ATP-dependent protease that degrades defective or denatured proteins as well as some folded proteins for the control of cellular protein quality and metabolism. Lon is a ta...
Lon proteases are distributed in all kingdoms of life and are required for survival of cells under stress. Lon is an oligomeric ATP-dependent protease that degrades defective or denatured proteins as well as some folded proteins for the control of cellular protein quality and metabolism. Lon is a tandem fusion of an AAA+ molecular chaperone and a protease with a serine-lysine catalytic dyad. Lon from Thermococcus onnurineus NA1 was purified and crystallized at 295 K. A 2.0 A ˚ resolution data set was collected using synchrotron radiation. The crystals belonged to space group P63, with unit cell parameters a= 121.45,b= 121.45,c= 195.24 A˚. Assuming the presence of two monomers in the asymmetric unit, the solvent content was estimated to be about 60.7%. The structure is a three tiered hexagonal cylinder with a large sequestered chamber accessible through an axial channel. Conserved loops extending from the AAA+ domain combine with an insertion domain containing the membrane anchor to form an apical domain that serves as a gate governing substrate access to an internal unfolding and degradation chamber. Alternating AAA+ domains are in tight- and weak-binding nucleotide states with different domain orientations and intersubunit contacts, reflecting intramolecular dynamics during ATP-driven protein unfolding and translocation. The bowl-shaped proteolytic chamber is contiguous with the chaperone chamber allowing internalized proteins direct access to the proteolytic sites without further gating restrictions.
Lon proteases are distributed in all kingdoms of life and are required for survival of cells under stress. Lon is an oligomeric ATP-dependent protease that degrades defective or denatured proteins as well as some folded proteins for the control of cellular protein quality and metabolism. Lon is a tandem fusion of an AAA+ molecular chaperone and a protease with a serine-lysine catalytic dyad. Lon from Thermococcus onnurineus NA1 was purified and crystallized at 295 K. A 2.0 A ˚ resolution data set was collected using synchrotron radiation. The crystals belonged to space group P63, with unit cell parameters a= 121.45,b= 121.45,c= 195.24 A˚. Assuming the presence of two monomers in the asymmetric unit, the solvent content was estimated to be about 60.7%. The structure is a three tiered hexagonal cylinder with a large sequestered chamber accessible through an axial channel. Conserved loops extending from the AAA+ domain combine with an insertion domain containing the membrane anchor to form an apical domain that serves as a gate governing substrate access to an internal unfolding and degradation chamber. Alternating AAA+ domains are in tight- and weak-binding nucleotide states with different domain orientations and intersubunit contacts, reflecting intramolecular dynamics during ATP-driven protein unfolding and translocation. The bowl-shaped proteolytic chamber is contiguous with the chaperone chamber allowing internalized proteins direct access to the proteolytic sites without further gating restrictions.
주제어
#AAA+ protein ATP-dependent protease compartmentalized protease protein quality control TonLon
학위논문 정보
저자
안영준
학위수여기관
명지대학교 대학원
학위구분
국내박사
학과
환경생명정보학과
지도교수
이상희
발행연도
2015
총페이지
viii, 79 p.
키워드
AAA+ protein ATP-dependent protease compartmentalized protease protein quality control TonLon
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