[학위논문]Pathological and molecular analysis of PepMoV-Vb1/GFP vector in host plant during serial passages : PepMoV-Vb1/GFP 벡터의 계대접종을 통한 병리학적 및 분자학적 분석원문보기
Pepper mottle virus (PepMoV)를 기반으로 구축된 바이러스 벡터pSP6PepMoV-Vb1/GFP는 선행 연구를 통해 N. benthamiana와 고추에서 전신 감염되는 것과 벡터 내에 삽입된 외래 유전자인 turboGFP가 벡터시스템에 의해 기주 내에서 녹색형광단백질을 활발히 발현시킴으로서 벡터의활성이 연구된 바 있다. 본 연구에서는 pSP6PepMoV-Vb1/GFP 벡터의 활용가능성을 알아보기 위해 N. benthamiana에서 계대접종을 통해 증식하여 자손 바이러스들의 병리학적 및 분자학적 특징을 분석했다. 계대접종을 위해 pSP6PepMoV-Vb1/GFP로부터 in vitro transcript를 생산하고 생성된PepMoV-Vb1/GFP를 초기 접종원으로 사용하여 N. benthamiana에 기계적 접종을 실시하였다. PepMoV-Vb1/GFP의 대조군으로는 pSP6PepMoV-Vb1에서 생산된 PepMoV-Vb1을 사용하여 같은 방법으로 접종하였다. 초기 접종(passage 0, PS0) 후 20일 간격으로 6회 계대접종을 진행하였고, 식물체는 접종 후 238일까지 유지하여 바이러스에 의한 병징과 GFP 발현 및 ...
Pepper mottle virus (PepMoV)를 기반으로 구축된 바이러스 벡터pSP6PepMoV-Vb1/GFP는 선행 연구를 통해 N. benthamiana와 고추에서 전신 감염되는 것과 벡터 내에 삽입된 외래 유전자인 turboGFP가 벡터시스템에 의해 기주 내에서 녹색형광단백질을 활발히 발현시킴으로서 벡터의활성이 연구된 바 있다. 본 연구에서는 pSP6PepMoV-Vb1/GFP 벡터의 활용가능성을 알아보기 위해 N. benthamiana에서 계대접종을 통해 증식하여 자손 바이러스들의 병리학적 및 분자학적 특징을 분석했다. 계대접종을 위해 pSP6PepMoV-Vb1/GFP로부터 in vitro transcript를 생산하고 생성된PepMoV-Vb1/GFP를 초기 접종원으로 사용하여 N. benthamiana에 기계적 접종을 실시하였다. PepMoV-Vb1/GFP의 대조군으로는 pSP6PepMoV-Vb1에서 생산된 PepMoV-Vb1을 사용하여 같은 방법으로 접종하였다. 초기 접종(passage 0, PS0) 후 20일 간격으로 6회 계대접종을 진행하였고, 식물체는 접종 후 238일까지 유지하여 바이러스에 의한 병징과 GFP 발현 및 염기서열변이 등을 확인 및 분석하였다. 바이러스의 병리학적 분석을 위해 PepMoV-Vb1/GFP와 대조군인 PepMoV-Vb1의 병징 차이와 녹색형광단백질의 발현을 7일마다 관찰하였다. 그 결과 PepMoV-Vb1/GFP와 PepMoV-Vb1에 감염된 식물체에 나타난 병징은 식물체의 생육 차이에 따라 미미한 차이를 보였지만, 전반적인 병징의 모습과 확산은 두 바이러스가 유사했고 GFP의 발현은 모든 계대된 바이러스에 의해 감염된 식물체의 접종 후 238일까지 안정적이게 발현된 것으로 관찰되었다. 분자학적 분석을 위해 바이러스의 염기서열 변이를 비교하였다. 감염된 잎 조직에서 바이러스 RNA를 분리하여 PepMoV-Vb1/GFP의 P1, CP 그리고 GFP 부위를 클로닝하였다. P1 부위는 Potyvirus에서 가장 염기서열 변이가 심한 부위로 알려져있고 CP 부위는 바이러스의 병원성에 가장 큰 역할을 하는 부위이며 GFP는 외래유전자이기 때문에 분석 부위로 선정되었다. 계대별 모든 자손 바이러스들의 mutation frequency를 비교한 결과, P1부분은 전체 염기서열 당 0.79 × 10-3, CP부분은 1.11 × 10-3, GFP 부분은 0.91 × 10-3의 mutation frequency를 나타냈다. 자손 바이러스의 아미노산 변이에서는, 가장 많이 일어난 돌연변이 타입은 P1 부위와 GFP부위에서는 비동의치환(non-synonymous substitution)이 각각 43.6%와 51.0%로 가장 많았고, CP 부위에서는 침묵돌연변이(silent)의 형태가 47.3%로 가장 많이 일어났다. 돌연변이가 일어난 부분의 염기서열변이와 아미노산 변화를 비교해보면 각 부위별 hot spot에서 일어난 변이를 제외하면 산발적인 변이로 나타났다. 본 연구 결과, PepMoV-Vb1/GFP 벡터는 병징에 있어서 대조군인 PepMoV-Vb1과 유사한 병징 특성을 나타냈고, 외래 유전자인 turboGFP는 세대를 거듭함에도 불구하고 안정적인 단백질 발현이 관찰되었다. 모든 passage에서 동일하게 염기서열의 변이가 일어난 hot spot 부위의 변이는 다른 PepMoV isolate들의 염기서열과 비교분석한 결과, 변이가 일어난 염기가 기존의 PepMoV isolate들의 밝혀진 염기와 같은 염기인 것이 대부분이었다. 때문에 hot spot 지점들에서 일어난 염기의 변이는 PepMoV 바이러스에 있어서 결정적인 역할을 하는 염기는 아닌 것으로 사료된다. 이 연구를 통하여 PepMoV-Vb1/GFP 벡터는 안정적인 단백질 발현 벡터로서의 활용 가능성을 보였다.
Pepper mottle virus (PepMoV)를 기반으로 구축된 바이러스 벡터pSP6PepMoV-Vb1/GFP는 선행 연구를 통해 N. benthamiana와 고추에서 전신 감염되는 것과 벡터 내에 삽입된 외래 유전자인 turboGFP가 벡터시스템에 의해 기주 내에서 녹색형광단백질을 활발히 발현시킴으로서 벡터의활성이 연구된 바 있다. 본 연구에서는 pSP6PepMoV-Vb1/GFP 벡터의 활용가능성을 알아보기 위해 N. benthamiana에서 계대접종을 통해 증식하여 자손 바이러스들의 병리학적 및 분자학적 특징을 분석했다. 계대접종을 위해 pSP6PepMoV-Vb1/GFP로부터 in vitro transcript를 생산하고 생성된PepMoV-Vb1/GFP를 초기 접종원으로 사용하여 N. benthamiana에 기계적 접종을 실시하였다. PepMoV-Vb1/GFP의 대조군으로는 pSP6PepMoV-Vb1에서 생산된 PepMoV-Vb1을 사용하여 같은 방법으로 접종하였다. 초기 접종(passage 0, PS0) 후 20일 간격으로 6회 계대접종을 진행하였고, 식물체는 접종 후 238일까지 유지하여 바이러스에 의한 병징과 GFP 발현 및 염기서열 변이 등을 확인 및 분석하였다. 바이러스의 병리학적 분석을 위해 PepMoV-Vb1/GFP와 대조군인 PepMoV-Vb1의 병징 차이와 녹색형광단백질의 발현을 7일마다 관찰하였다. 그 결과 PepMoV-Vb1/GFP와 PepMoV-Vb1에 감염된 식물체에 나타난 병징은 식물체의 생육 차이에 따라 미미한 차이를 보였지만, 전반적인 병징의 모습과 확산은 두 바이러스가 유사했고 GFP의 발현은 모든 계대된 바이러스에 의해 감염된 식물체의 접종 후 238일까지 안정적이게 발현된 것으로 관찰되었다. 분자학적 분석을 위해 바이러스의 염기서열 변이를 비교하였다. 감염된 잎 조직에서 바이러스 RNA를 분리하여 PepMoV-Vb1/GFP의 P1, CP 그리고 GFP 부위를 클로닝하였다. P1 부위는 Potyvirus에서 가장 염기서열 변이가 심한 부위로 알려져있고 CP 부위는 바이러스의 병원성에 가장 큰 역할을 하는 부위이며 GFP는 외래유전자이기 때문에 분석 부위로 선정되었다. 계대별 모든 자손 바이러스들의 mutation frequency를 비교한 결과, P1부분은 전체 염기서열 당 0.79 × 10-3, CP부분은 1.11 × 10-3, GFP 부분은 0.91 × 10-3의 mutation frequency를 나타냈다. 자손 바이러스의 아미노산 변이에서는, 가장 많이 일어난 돌연변이 타입은 P1 부위와 GFP부위에서는 비동의치환(non-synonymous substitution)이 각각 43.6%와 51.0%로 가장 많았고, CP 부위에서는 침묵돌연변이(silent)의 형태가 47.3%로 가장 많이 일어났다. 돌연변이가 일어난 부분의 염기서열변이와 아미노산 변화를 비교해보면 각 부위별 hot spot에서 일어난 변이를 제외하면 산발적인 변이로 나타났다. 본 연구 결과, PepMoV-Vb1/GFP 벡터는 병징에 있어서 대조군인 PepMoV-Vb1과 유사한 병징 특성을 나타냈고, 외래 유전자인 turboGFP는 세대를 거듭함에도 불구하고 안정적인 단백질 발현이 관찰되었다. 모든 passage에서 동일하게 염기서열의 변이가 일어난 hot spot 부위의 변이는 다른 PepMoV isolate들의 염기서열과 비교분석한 결과, 변이가 일어난 염기가 기존의 PepMoV isolate들의 밝혀진 염기와 같은 염기인 것이 대부분이었다. 때문에 hot spot 지점들에서 일어난 염기의 변이는 PepMoV 바이러스에 있어서 결정적인 역할을 하는 염기는 아닌 것으로 사료된다. 이 연구를 통하여 PepMoV-Vb1/GFP 벡터는 안정적인 단백질 발현 벡터로서의 활용 가능성을 보였다.
Pepper mottle virus (PepMoV)-based vector expressing green fluorescent protein (GFP) (pSP6PepMoV-Vb1/GFP) shows infectivity and stable GFP expression systemically in Nicotiana benthamiana and pepper species. In this study, to investigate the diversity of the progeny viruses produced from the PepMoV-...
Pepper mottle virus (PepMoV)-based vector expressing green fluorescent protein (GFP) (pSP6PepMoV-Vb1/GFP) shows infectivity and stable GFP expression systemically in Nicotiana benthamiana and pepper species. In this study, to investigate the diversity of the progeny viruses produced from the PepMoV-Vb1/GFP, transcript generated from pSP6PepMoV-Vb1/GFP was initially inoculated on to N. benthamiana and six serial passages were performed at intervals of 20 days and maintained to 238 days post inoculation (dpi). The virus symptoms and GFP signals were monitored and sequence variation were investigated in the P1, coat protein (CP) and GFP region. In these regions, sequence variation was compared with the wild type virus sequence during passages. The symptom and virus concentration were similar to wild type virus-infected plants. The percentage of mutations of progeny viruses fluctuated and the mutation frequencies showed distributions over serial passages in three analyzed regions (P1, CP and GFP). The majority of observed mutations in the viral populations were non-synonymous substitutions 43.6% and 51.0% in the P1 region and GFP region, respectively, and silent 47.3% in the CP region. Mutation frequencies were 0.79, 1.11 and 0.91 × 10-3 per nucleotide in the P1, CP and GFP region, respectively. In this study, PepMoV-Vb1/GFP vector was identical with wild type virus (PepMoV-Vb1) in symptoms and sequence variation. Therefore, this vector is regarded as a stable viral vector that can be utilized for stable protein expression.
Pepper mottle virus (PepMoV)-based vector expressing green fluorescent protein (GFP) (pSP6PepMoV-Vb1/GFP) shows infectivity and stable GFP expression systemically in Nicotiana benthamiana and pepper species. In this study, to investigate the diversity of the progeny viruses produced from the PepMoV-Vb1/GFP, transcript generated from pSP6PepMoV-Vb1/GFP was initially inoculated on to N. benthamiana and six serial passages were performed at intervals of 20 days and maintained to 238 days post inoculation (dpi). The virus symptoms and GFP signals were monitored and sequence variation were investigated in the P1, coat protein (CP) and GFP region. In these regions, sequence variation was compared with the wild type virus sequence during passages. The symptom and virus concentration were similar to wild type virus-infected plants. The percentage of mutations of progeny viruses fluctuated and the mutation frequencies showed distributions over serial passages in three analyzed regions (P1, CP and GFP). The majority of observed mutations in the viral populations were non-synonymous substitutions 43.6% and 51.0% in the P1 region and GFP region, respectively, and silent 47.3% in the CP region. Mutation frequencies were 0.79, 1.11 and 0.91 × 10-3 per nucleotide in the P1, CP and GFP region, respectively. In this study, PepMoV-Vb1/GFP vector was identical with wild type virus (PepMoV-Vb1) in symptoms and sequence variation. Therefore, this vector is regarded as a stable viral vector that can be utilized for stable protein expression.
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