O-GlcNAc 수식화는 생명체에서 중요한 전사 후 변형 중 하나이며, O-GlcNAc 수식화 효소 (OGT)와 O-GlcNAcase (OGA)의 두 효소에 의해서 조절된다. OGT는 당 공여체인 UDP-GlcNAc으로부터 한 분자의 GlcNAc을 단백질의 serine 또는 threonine 잔기에 전이시키는 과정을 촉매하는 효소이며, OGA는 이와 반대로 제거하는 과정을 촉매한다. 본 연구에서는 Magnaporthe grisea와 Yarrowia lipolytica를 포함하는 다수의 균류에서 OGT로 추정되는 유전자가 존재함을 확인하였다. 기존 연구에 따르면, 인간 OGT의 촉매 기저 잔기는 ...
O-GlcNAc 수식화는 생명체에서 중요한 전사 후 변형 중 하나이며, O-GlcNAc 수식화 효소 (OGT)와 O-GlcNAcase (OGA)의 두 효소에 의해서 조절된다. OGT는 당 공여체인 UDP-GlcNAc으로부터 한 분자의 GlcNAc을 단백질의 serine 또는 threonine 잔기에 전이시키는 과정을 촉매하는 효소이며, OGA는 이와 반대로 제거하는 과정을 촉매한다. 본 연구에서는 Magnaporthe grisea와 Yarrowia lipolytica를 포함하는 다수의 균류에서 OGT로 추정되는 유전자가 존재함을 확인하였다. 기존 연구에 따르면, 인간 OGT의 촉매 기저 잔기는 히스티딘 558 또는 히스티딘 498 임이 제시되었다. 본 연구에서는 히스티딘 558 잔기는 모든 종에서 매우 보존되었으며, 히스티딘 498은 동물에서만 보존된 반면에 이웃하는 잔기인 히스티딘 499는 모든 종에서 매우 보존되었음을 확인하였다. 따라서, 히스티딘 499 또는 558이 OGT의 촉매 기저임을 추측하는 바이다. 염기서열 분석을 통해 M. grisea OGT (MgOGT)와 Y. lipolytica OGT (YlOGT)는 다른 OGT들과 유사한 활성 부위가 존재함을 확인하였으며, 두 OGT도 같은 효소 활성을 나타낼 것으로 보인다. MgOGT와 YlOGT를 각각 재조합 단백질로 효모 S. cerevisiae에 발현하였다. 면역 블로팅 분석은 재조합 MgOGT와 YlOGT가 높은 발현을 나타내나 자가 O-GlcNAc 수식화를 하지 않는 것으로 보였다. 또한 방사선 표지된 UDP-GlcNAc을 이용한 효소 활성 분석에서도 재조합 MgOGT와 YlOGT는 활성을 나타내지 않았다. 반면에 S. cerevisiae에서 발현된 인간의 OGT는 자가 O-GlcNAc 수식화를 하며 효소 활성도 갖는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 인간 OGT의 과발현은 S. cerevisiae의 성장 표현형에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 결론적으로 여러 종들의 균류에서 OGT가 존재하며 다른 종들에서 관찰되었던 전형적인 기능적 구조를 지님이 생물정보학적 분석으로 확인하였고, 이 중 두 종의 OGT는 S. cerevisiae에서 재조합 단백질로 발현되었다. 이 연구를 통해서 얻어진 정보와 결과는 이후의 다양한 균류에 존재하는 OGT의 기능 연구에 유용하게 활용될 수 있는 기반을 제공할 것이다.
O-GlcNAc 수식화는 생명체에서 중요한 전사 후 변형 중 하나이며, O-GlcNAc 수식화 효소 (OGT)와 O-GlcNAcase (OGA)의 두 효소에 의해서 조절된다. OGT는 당 공여체인 UDP-GlcNAc으로부터 한 분자의 GlcNAc을 단백질의 serine 또는 threonine 잔기에 전이시키는 과정을 촉매하는 효소이며, OGA는 이와 반대로 제거하는 과정을 촉매한다. 본 연구에서는 Magnaporthe grisea와 Yarrowia lipolytica를 포함하는 다수의 균류에서 OGT로 추정되는 유전자가 존재함을 확인하였다. 기존 연구에 따르면, 인간 OGT의 촉매 기저 잔기는 히스티딘 558 또는 히스티딘 498 임이 제시되었다. 본 연구에서는 히스티딘 558 잔기는 모든 종에서 매우 보존되었으며, 히스티딘 498은 동물에서만 보존된 반면에 이웃하는 잔기인 히스티딘 499는 모든 종에서 매우 보존되었음을 확인하였다. 따라서, 히스티딘 499 또는 558이 OGT의 촉매 기저임을 추측하는 바이다. 염기서열 분석을 통해 M. grisea OGT (MgOGT)와 Y. lipolytica OGT (YlOGT)는 다른 OGT들과 유사한 활성 부위가 존재함을 확인하였으며, 두 OGT도 같은 효소 활성을 나타낼 것으로 보인다. MgOGT와 YlOGT를 각각 재조합 단백질로 효모 S. cerevisiae에 발현하였다. 면역 블로팅 분석은 재조합 MgOGT와 YlOGT가 높은 발현을 나타내나 자가 O-GlcNAc 수식화를 하지 않는 것으로 보였다. 또한 방사선 표지된 UDP-GlcNAc을 이용한 효소 활성 분석에서도 재조합 MgOGT와 YlOGT는 활성을 나타내지 않았다. 반면에 S. cerevisiae에서 발현된 인간의 OGT는 자가 O-GlcNAc 수식화를 하며 효소 활성도 갖는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 인간 OGT의 과발현은 S. cerevisiae의 성장 표현형에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 결론적으로 여러 종들의 균류에서 OGT가 존재하며 다른 종들에서 관찰되었던 전형적인 기능적 구조를 지님이 생물정보학적 분석으로 확인하였고, 이 중 두 종의 OGT는 S. cerevisiae에서 재조합 단백질로 발현되었다. 이 연구를 통해서 얻어진 정보와 결과는 이후의 다양한 균류에 존재하는 OGT의 기능 연구에 유용하게 활용될 수 있는 기반을 제공할 것이다.
O-GlcNAc glycosylation is an important post-translational modification for many cellular processes, and it is regulated by O-GlcNAc transferases (OGTs) and O-GlcNAcases (OGAs). OGTs catalyze the addition of β-D-N-acetylglucosamine from UDP-GlcNAc to the serine or threonine residues of target protein...
O-GlcNAc glycosylation is an important post-translational modification for many cellular processes, and it is regulated by O-GlcNAc transferases (OGTs) and O-GlcNAcases (OGAs). OGTs catalyze the addition of β-D-N-acetylglucosamine from UDP-GlcNAc to the serine or threonine residues of target proteins, which can be removed by OGAs. In this study, by bioinformatics analysis, I identified and compared structural domains of that putative OGTs present in diverse fungal species including Magnaporthe grisea and Yarrowia lipolytica. Previously, the histidine 499 or 558 was proposed the catalytic domain of human OGT. It was revealed that the histidine residue corresponding to the histidine 558 of human OGT is highly conserved across all species. Interestingly, the histidine residue equivalent to the histidine 498 of human OGT is shown to be conserved only in animals, while the histidine residue equivalent to the histidine 499 of human OGT is revealed to be highly conserved across all species. Therefore, it is possible that either of histidine 498 or 558 could be the catalytic base of OGTs. Sequence analysis showed that M. grisea OGT (MgOGT) and Y. lipolytica OGT (YlOGT) have the well-conserved catalytic domain, suggesting these OGTs may have the catalytic activity. I expressed these fungal OGTs and human OGT as recombinant proteins in S. cerevisiae for biochemical characterization. Immunoblotting analysis with the antibody against O-GlcNAc showed that recombinant MgOGT and YlOGT were not subject to auto-O-GlcNAcylation modification. Moreover, the recombinant MgOGT and YlOGT did not show enzyme activity in the in vitro assay. On the other hands, the recombinant human OGT expressed in S. cerevisiae showed auto-O-GlcNAcylation, and the in vitro catalytic activity. Interestingly, overexpression of human OGT affected negatively on the growth phenotype of S. cerevisiae. It is expected that the information and resources of fungal OGTs obtained in this study should be useful for further detailed functional studies of fungal OGTs to elucidate their physiological roles.
O-GlcNAc glycosylation is an important post-translational modification for many cellular processes, and it is regulated by O-GlcNAc transferases (OGTs) and O-GlcNAcases (OGAs). OGTs catalyze the addition of β-D-N-acetylglucosamine from UDP-GlcNAc to the serine or threonine residues of target proteins, which can be removed by OGAs. In this study, by bioinformatics analysis, I identified and compared structural domains of that putative OGTs present in diverse fungal species including Magnaporthe grisea and Yarrowia lipolytica. Previously, the histidine 499 or 558 was proposed the catalytic domain of human OGT. It was revealed that the histidine residue corresponding to the histidine 558 of human OGT is highly conserved across all species. Interestingly, the histidine residue equivalent to the histidine 498 of human OGT is shown to be conserved only in animals, while the histidine residue equivalent to the histidine 499 of human OGT is revealed to be highly conserved across all species. Therefore, it is possible that either of histidine 498 or 558 could be the catalytic base of OGTs. Sequence analysis showed that M. grisea OGT (MgOGT) and Y. lipolytica OGT (YlOGT) have the well-conserved catalytic domain, suggesting these OGTs may have the catalytic activity. I expressed these fungal OGTs and human OGT as recombinant proteins in S. cerevisiae for biochemical characterization. Immunoblotting analysis with the antibody against O-GlcNAc showed that recombinant MgOGT and YlOGT were not subject to auto-O-GlcNAcylation modification. Moreover, the recombinant MgOGT and YlOGT did not show enzyme activity in the in vitro assay. On the other hands, the recombinant human OGT expressed in S. cerevisiae showed auto-O-GlcNAcylation, and the in vitro catalytic activity. Interestingly, overexpression of human OGT affected negatively on the growth phenotype of S. cerevisiae. It is expected that the information and resources of fungal OGTs obtained in this study should be useful for further detailed functional studies of fungal OGTs to elucidate their physiological roles.
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