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전이와 재발이 높은 간암에서 암 줄기세포를 얻기 위하여 배양 시 환경은 매우 중요하다. 구성 형성 배양은 암 줄기세포가 세포배양 접시에 부착하지 않고도 잘 자란다는 줄기세포적 특징을 이용한 방법으로서 많이 사용되고 있다. 본 실험에서는 간암 세포 주를 이용하여 세가지 종류의 배양액에서 구체 형성 배양의 효율을 비교 하였다. 간암 세포 주 Huh7, HepG2를 이용하여 각각 다른 배양액에 구성 형성 배양을 하였다. 각 군의 구체 형성 세포의 줄기세포적 특징을 분석하기 위하여 세포 증식률을 비교 하였으며, 역전위 ...

전이와 재발이 높은 간암에서 암 줄기세포를 얻기 위하여 배양 시 환경은 매우 중요하다. 구성 형성 배양은 암 줄기세포가 세포배양 접시에 부착하지 않고도 잘 자란다는 줄기세포적 특징을 이용한 방법으로서 많이 사용되고 있다. 본 실험에서는 간암 세포 주를 이용하여 세가지 종류의 배양액에서 구체 형성 배양의 효율을 비교 하였다. 간암 세포 주 Huh7, HepG2를 이용하여 각각 다른 배양액에 구성 형성 배양을 하였다. 각 군의 구체 형성 세포의 줄기세포적 특징을 분석하기 위하여 세포 증식률을 비교 하였으며, 역전위 중합 효소 연쇄 반응으로 줄기세포성 유전자 Oct4, Nanog, Sox2와 간암줄기세포에서 많이 발현된다는 EpCAM 간암의 전이와 증식에 관련 된 Connexin32, Connexin43의 발현을 확인하였다. 또한 면역세포염색법으로 암 줄기세포에서 많이 발현되는 표지자들 CD90, CD133, E-cadherin, β-catenin, 을 확인하였다. 발현되는 세포의 측정을 위하여 흐름세포 측정법을 사용하여 줄기세포 표지자들 Oct4, Nanog, Sox2와 CD133, Connexin32의 발현을 확인하였다. 구체 형성 배양 초기에는 control 배양액의 세포의 증식률이 DMEM(+)FBS, DMEM(-)FBS 배양액의 세포와 비교했을 때 높은 것을 알 수 있었다. 하지만 15일 이후부터 DMEM(+)FBS 배양액의 세포의 증식률이 높았으며 control 배양액의 세포는 줄어드는 것을 관찰 할 수 있었다. DMEM(-)FBS 배양액의 세포는 구체 형성을 하지 못하였으며 세포가 사멸 된 것을 볼 수 있었다. control, DMEM(+)FBS 군의 세포들은 유전자의 발현과 표지자의 발현이 유사하게 발현되는 것을 알 수 있었다. 위의 결과들로 보아 control, DMEM(+)FBS 배양액의 구체 형성 세포들은 유사한 특징을 갖고 있었으며, 성장인자를 넣어주지 않고 혈청이 포함된 배양액에서도 구체 형성을 하며, 증식이 가능하고 암 줄기세포의 특징을 갖고 있는 것을 확인할 수 있었다. 본 연구는 구체 형성 배양 시 성장인자의 첨가 없이 암 줄기세포의 구성 형성 배양이 가능하다면 더 간단한 방법으로 암 줄기세포의 배양이 가능할 것이며 비용적인 면에서 절감할 수 있을 것이라고 생각한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Cancer stem cells are one of the biggest causes of tumor metastasis and recurrence. Culture environments are very important to obtain the cancer stem cells in vitro. Sphere formation is a culture method for cancer stem cells. In this study, we validated to optimal culture condition for sphere format...

Cancer stem cells are one of the biggest causes of tumor metastasis and recurrence. Culture environments are very important to obtain the cancer stem cells in vitro. Sphere formation is a culture method for cancer stem cells. In this study, we validated to optimal culture condition for sphere formation of hepatocellular carcinoma cell line using three different types of culture media. Huh7 and HepG2 cells were plated in different culture media allowed for sphere formation. To confirm the stemness characteristics of sphere cells, the proliferation, and expression of stem cell markers of Huh7 sphere-forming cells were checked. And we evaluated the gene expression of cancer stem cells by RT-PCR analysis with EpCAM, Connexin32 and Connexin43 primers and Immunocytochemistry assay with CD90, CD133, E-cadherin, β-catenin, antibodies on sphere-forming cells. Flow cytometry was provided to confirm stem cell markers and Connexin32, CD133. Huh7 and HepG2 sphere-forming Cells in control media showed higher level of cell proliferation than in DMEM(+)FBS or DMEM(-)FBS media cells on 7 days, while DMEM(+)FBS media cells exhibited higher level than others on post 20 days. Proliferation of DMEM(-)FBS media cells did not improve; consequently, it was impossible to obtain sufficient amount of cell for further analysis. DMEM(+)FBS and control media cells had similar tendency on expression of cell surface markers. In results of flow cytometry, there were no significant differences between two groups. In conclusion, results showed that sphere-forming cells in DMEM(+)FBS and control media had similar character. So, it is assumed that a growth factor-free medium is adaptable or efficient tool for in vitro cultivation of cancer stem cells, because the tool shall be reduced expense for experiments without the adding of growth factors.

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