산화적스트레스(oxidative stress)로 유도된 간 손상과 피부노화에 미치는 미더덕(Styela clava) 껍질 에탄올 추출물의 약리 효과 Pharmacological effects of ethanol extract collected from Styela clava tunic on oxidative stress induced hepatic injury and skin aging원문보기
고은경
(Pusan National University
Department of Biomaterials Engineering
국내석사)
활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)은 산소원자로부터 유래된 화학적으로 반응성이 높은 여러 가지 분자들과 자유라디칼들(free radicals)이다. 초과산화물(superperoxide), 과산화수소(hydrogen peroxide), 히드록시라디칼(hydroxylradicals), 수산화이온(hydroxyl ion) 및 산화질소(nitric oxide) 등이 포함된 이러한 분자들은 산소호흡과정(aerobic respiration) 시 일어나는 ...
활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)은 산소원자로부터 유래된 화학적으로 반응성이 높은 여러 가지 분자들과 자유라디칼들(free radicals)이다. 초과산화물(superperoxide), 과산화수소(hydrogen peroxide), 히드록시라디칼(hydroxylradicals), 수산화이온(hydroxyl ion) 및 산화질소(nitric oxide) 등이 포함된 이러한 분자들은 산소호흡과정(aerobic respiration) 시 일어나는 미토콘드리아(mitochondria) 내 전자전달이나 산화를 촉매하는 금속과 산화환원효소(oxido-reductase enzymes)에 의해 생성된다. 또한, ROS는 세포사(apoptosis), 유전자 발현(gene expression), 세포 활성(cell activation) 및 방어 메커니즘(defense mechanism) 동안에 정상세포 신호전달(normal cell signal transduction)과 세포주기에서 중요한 전달자로서 역할을 수행한다. 특별히, 포유동물 내에서 방어메커니즘의 일부는 ROS의 생성과 제거속도의 균형을 철저히 조절한다. ROS의 불균형이 친산화적 상태(pro-oxidative state)쪽으로 이동할 때, 산화적 스트레스(oxidative stress)는 항산화제(antioxidant) 혹은 항산화와 관련된 효소의 결핍에 의해서 유발되며, DNA의 손상, 불포화 지방산(polyunsaturated fatty acids)의 산화, 과산화지질(lipid peroxidation), 단백질을 구성하는 아미노산의 산화 등 다양한 해로운 효과(harmful effects)를 유발하게 된다. 한편, ROS로 인해 증가되는 산화적 스트레스는 종양형성(tumorigenesis), 동맥경화증(atherosclerosis), 비만(diabetes), 노화관련 질병(aging disease), 간 및 폐질환(liver and lung disease), 심혈관계질환(cardiovascular disease), 신경퇴행성질환(neurodegenerative disease) 및 감염질환(infectious disease) 등 다양한 인체 질환들의 발병 및 진행의 원인으로 작용한다. 하지만 이러한 인체질환들은 글루타치온, 비타민 C, A, E 등과 같은 다양한 형태의 항산화제에 의해 효과적으로 예방된다. 최근 천연자원으로부터 발견된 항산화제들은 산화스트레스로 유도된 질병의 예방 및 치료효과에 높은 활성을 보이고 있어 주목받고 있다. 이러한 자원들 가운데, 미더덕껍질(Styela clava tunic, SCT)은 고분자와 다양한 생활성 화합물을 포함하고 있어 염증, 산화스트레스 및 창상 등에 우수한 효능을 보이고 있다. 하지만, 비록 미삭동물아문(subphylum Urochordata)에 속하는 여러 종의 껍질에서 추출한 물질의 간 보호효능에 대한 연구는 보고되었지만 SCT가 독성 화학물질(toxic chemical)이나 물리적 처리(physical treatment)에 의해 생성된 산화적스트레스로 인해 발생한 간 손상(liver injury)과 피부노화(skin aging)에 대한 예방효과와 작용 메커니즘에 대한 연구는 보고되지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 사염화탄소(CCl4)로 유도된 ICR 마우스의 간 손상과 자외선(Ultraviolet, UV)으로 유도된 hairless 마우스의 피부 노화에 대한 SCT의 에탄올 추출물(ethanol extract collected from SCT; EtSCT)의 약리효능을 규명하고자 하였으며, 이들의 간과 신장에 미치는 독성도 평가하고자 하였다. 먼저, EtSCT는 건조된 미더덕 껍질에 100% 에탄올을 첨가하여 80℃에서 3시간 추출하여 준비하였다. EtSCT가 CCl4로유도된 ICR 마우스의 간 손상에 미치는 보호 효과를 평가하기 위하여 ICR 마우스에 EtSCT를 5일간 위내투여한 후 CCl4를 복강 주사하여 혈청 생화학 검사, 조직학적 검사, 간 세포사멸, 염증 및 섬유화에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과, EtSCT+CCl4처리그룹에서, 간의 독성 및 세포 괴사의 지표인 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase, ALT), 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 및 아스파르트산 아미노전이효소(aspartate aminotransferase, AST)가 감소하였으며 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase, ALP)는 일정하게 유지되었다. 또한, EtSCT+CCl4의 처리는 active caspase-3의 형성 및 Bax/Bcl-2 발현을 효과적으로 저해하였다. 더불어, EtSCT+CCl4 처리그룹은 p38 단백질의 인산화와 전염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 수치를 감소시켰으며 TNF-α 하위 신호전달경로의 회복을 촉진시켰다. 또한 EtSCT+CCl4의 처리는 간 섬유화의 지표인 콜라겐의 침적을 비롯하여 기질금속단백질분해효소-2(matrix metalloprotease-2, MMP-2)의 발현, 형질전환성장인자-β1(transforming growth factor- β1, TGF-β1) 농도 및 Smad2/3의 인산화를 효과적으로 감소시켰다. 더불어, EtSCT+CCl4 처리 그룹에서 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA)의 농도 감소와 항산화효소(Superoxide dismutase, SOD)의 발현 증가가 관찰되었다. 다음으로, EtSCT가 UV로 유도된 피부노화에 미치는 치료 효능을 평가하기 위하여 hairless 마우스의 등쪽에 13 주간 UV의 조사 및 EtSCT의 도포하여 피부의 표현형 분석, 조직학적 분석, 염증, 소포체스트레스(Endoplasmic reticulum stress; ER stress), 항산화 효능을 분석하였다. 그 결과, EtSCT의 도포는 UV에 의한 광노화 피부의 주름(wrinkles) 형성, 홍반도(erythema index) 감소, 표피 수분 손실도(transepidermal water loss, TEWL)를 감소시켰다. 또한, UV+EtSCT 처리그룹은 UV+Vehicle 처리 그룹에 비하여 표피 두께와 지방세포 수가 감소하였으며, 콜라겐의 발현이 증가하였다. 더불어, UV+EtSCT 처리 그룹에서 ROS로 활성화된 MAP(Mitogen-activated protein) kinase 및 ER stress 신호전달경로의 활성화가 감소됨을 관찰하였으며, 비만세포(mast cell)의 침투에 관련된 인자인 CD31 및 염증 사이토카인인 IL-6의 농도를 감소시켰다. 또한, UV+EtSCT 처리그룹에서 MDA의 농도 감소 및 SOD의 활성도가 유의적으로 증가하였다. 마지막으로, EtSCT의 간 독성 및 신장 독성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 ICR 마우스에 50 mg/kg 및 100 mg/kg의 EtSCT를 14일간 위내 투여 후 체중 및 장기 무게 변화, 혈청 생화학검사, 뇨 분석, 조직학적 분석을 실시하였다. 그 결과, EtSCT의 처리는 체중과 장기 무게에 영향을 미치지 않았으며, 특이적인 병리학적인 증상과 뇨수치의 변화를 유발하지 않았다. 또한, SCT는 혈청생화학적지표인 ALP, ALT, AST, 혈액요소질소(blood urea nitrogen, BUN), 크레아티 (creainin, CRE)의 수치의 변화를 유발하지 않았으며, 간과 신장의 조직에서 독성 물질의 유도로 인해 일반적으로 관찰되는 병리학적인 특징을 유도하지 않았다. 이상의 결과들은 EtSCT가 간세포사멸의 억제, 염증반응감소, 섬유화 감소 등을 통하여 CCl4로 유도된 간 손상을 보호하며, UV로 유도된 피부의 형태학적과 조직학적 구조의 회복, ER stress 억제, 염증반응 억제, 산화적 능력향상 등을 통하여 피부노화를 억제함을 제시하고 있다. 또한, EtSCT는 실험동물에서 간과 신장을 포함한 다른 기관에 독성을 유발하지 않음을 제시하고 있다. 따라서, 이러한 결과들은 EtSCT가 간질환과 피부노화의 우수한 보호제와 치료제로서의 가능성을 갖고 있음을 제시하고 있다.
활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)은 산소원자로부터 유래된 화학적으로 반응성이 높은 여러 가지 분자들과 자유라디칼들(free radicals)이다. 초과산화물(superperoxide), 과산화수소(hydrogen peroxide), 히드록시라디칼(hydroxylradicals), 수산화이온(hydroxyl ion) 및 산화질소(nitric oxide) 등이 포함된 이러한 분자들은 산소호흡과정(aerobic respiration) 시 일어나는 미토콘드리아(mitochondria) 내 전자전달이나 산화를 촉매하는 금속과 산화환원효소(oxido-reductase enzymes)에 의해 생성된다. 또한, ROS는 세포사(apoptosis), 유전자 발현(gene expression), 세포 활성(cell activation) 및 방어 메커니즘(defense mechanism) 동안에 정상세포 신호전달(normal cell signal transduction)과 세포주기에서 중요한 전달자로서 역할을 수행한다. 특별히, 포유동물 내에서 방어메커니즘의 일부는 ROS의 생성과 제거속도의 균형을 철저히 조절한다. ROS의 불균형이 친산화적 상태(pro-oxidative state)쪽으로 이동할 때, 산화적 스트레스(oxidative stress)는 항산화제(antioxidant) 혹은 항산화와 관련된 효소의 결핍에 의해서 유발되며, DNA의 손상, 불포화 지방산(polyunsaturated fatty acids)의 산화, 과산화지질(lipid peroxidation), 단백질을 구성하는 아미노산의 산화 등 다양한 해로운 효과(harmful effects)를 유발하게 된다. 한편, ROS로 인해 증가되는 산화적 스트레스는 종양형성(tumorigenesis), 동맥경화증(atherosclerosis), 비만(diabetes), 노화관련 질병(aging disease), 간 및 폐질환(liver and lung disease), 심혈관계질환(cardiovascular disease), 신경퇴행성질환(neurodegenerative disease) 및 감염질환(infectious disease) 등 다양한 인체 질환들의 발병 및 진행의 원인으로 작용한다. 하지만 이러한 인체질환들은 글루타치온, 비타민 C, A, E 등과 같은 다양한 형태의 항산화제에 의해 효과적으로 예방된다. 최근 천연자원으로부터 발견된 항산화제들은 산화스트레스로 유도된 질병의 예방 및 치료효과에 높은 활성을 보이고 있어 주목받고 있다. 이러한 자원들 가운데, 미더덕껍질(Styela clava tunic, SCT)은 고분자와 다양한 생활성 화합물을 포함하고 있어 염증, 산화스트레스 및 창상 등에 우수한 효능을 보이고 있다. 하지만, 비록 미삭동물아문(subphylum Urochordata)에 속하는 여러 종의 껍질에서 추출한 물질의 간 보호효능에 대한 연구는 보고되었지만 SCT가 독성 화학물질(toxic chemical)이나 물리적 처리(physical treatment)에 의해 생성된 산화적스트레스로 인해 발생한 간 손상(liver injury)과 피부노화(skin aging)에 대한 예방효과와 작용 메커니즘에 대한 연구는 보고되지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 사염화탄소(CCl4)로 유도된 ICR 마우스의 간 손상과 자외선(Ultraviolet, UV)으로 유도된 hairless 마우스의 피부 노화에 대한 SCT의 에탄올 추출물(ethanol extract collected from SCT; EtSCT)의 약리효능을 규명하고자 하였으며, 이들의 간과 신장에 미치는 독성도 평가하고자 하였다. 먼저, EtSCT는 건조된 미더덕 껍질에 100% 에탄올을 첨가하여 80℃에서 3시간 추출하여 준비하였다. EtSCT가 CCl4로유도된 ICR 마우스의 간 손상에 미치는 보호 효과를 평가하기 위하여 ICR 마우스에 EtSCT를 5일간 위내투여한 후 CCl4를 복강 주사하여 혈청 생화학 검사, 조직학적 검사, 간 세포사멸, 염증 및 섬유화에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과, EtSCT+CCl4처리그룹에서, 간의 독성 및 세포 괴사의 지표인 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase, ALT), 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 및 아스파르트산 아미노전이효소(aspartate aminotransferase, AST)가 감소하였으며 알칼리성 인산가수분해효소(alkaline phosphatase, ALP)는 일정하게 유지되었다. 또한, EtSCT+CCl4의 처리는 active caspase-3의 형성 및 Bax/Bcl-2 발현을 효과적으로 저해하였다. 더불어, EtSCT+CCl4 처리그룹은 p38 단백질의 인산화와 전염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 수치를 감소시켰으며 TNF-α 하위 신호전달경로의 회복을 촉진시켰다. 또한 EtSCT+CCl4의 처리는 간 섬유화의 지표인 콜라겐의 침적을 비롯하여 기질금속단백질분해효소-2(matrix metalloprotease-2, MMP-2)의 발현, 형질전환성장인자-β1(transforming growth factor- β1, TGF-β1) 농도 및 Smad2/3의 인산화를 효과적으로 감소시켰다. 더불어, EtSCT+CCl4 처리 그룹에서 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA)의 농도 감소와 항산화효소(Superoxide dismutase, SOD)의 발현 증가가 관찰되었다. 다음으로, EtSCT가 UV로 유도된 피부노화에 미치는 치료 효능을 평가하기 위하여 hairless 마우스의 등쪽에 13 주간 UV의 조사 및 EtSCT의 도포하여 피부의 표현형 분석, 조직학적 분석, 염증, 소포체스트레스(Endoplasmic reticulum stress; ER stress), 항산화 효능을 분석하였다. 그 결과, EtSCT의 도포는 UV에 의한 광노화 피부의 주름(wrinkles) 형성, 홍반도(erythema index) 감소, 표피 수분 손실도(transepidermal water loss, TEWL)를 감소시켰다. 또한, UV+EtSCT 처리그룹은 UV+Vehicle 처리 그룹에 비하여 표피 두께와 지방세포 수가 감소하였으며, 콜라겐의 발현이 증가하였다. 더불어, UV+EtSCT 처리 그룹에서 ROS로 활성화된 MAP(Mitogen-activated protein) kinase 및 ER stress 신호전달경로의 활성화가 감소됨을 관찰하였으며, 비만세포(mast cell)의 침투에 관련된 인자인 CD31 및 염증 사이토카인인 IL-6의 농도를 감소시켰다. 또한, UV+EtSCT 처리그룹에서 MDA의 농도 감소 및 SOD의 활성도가 유의적으로 증가하였다. 마지막으로, EtSCT의 간 독성 및 신장 독성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 ICR 마우스에 50 mg/kg 및 100 mg/kg의 EtSCT를 14일간 위내 투여 후 체중 및 장기 무게 변화, 혈청 생화학검사, 뇨 분석, 조직학적 분석을 실시하였다. 그 결과, EtSCT의 처리는 체중과 장기 무게에 영향을 미치지 않았으며, 특이적인 병리학적인 증상과 뇨수치의 변화를 유발하지 않았다. 또한, SCT는 혈청생화학적지표인 ALP, ALT, AST, 혈액요소질소(blood urea nitrogen, BUN), 크레아티 (creainin, CRE)의 수치의 변화를 유발하지 않았으며, 간과 신장의 조직에서 독성 물질의 유도로 인해 일반적으로 관찰되는 병리학적인 특징을 유도하지 않았다. 이상의 결과들은 EtSCT가 간세포사멸의 억제, 염증반응감소, 섬유화 감소 등을 통하여 CCl4로 유도된 간 손상을 보호하며, UV로 유도된 피부의 형태학적과 조직학적 구조의 회복, ER stress 억제, 염증반응 억제, 산화적 능력향상 등을 통하여 피부노화를 억제함을 제시하고 있다. 또한, EtSCT는 실험동물에서 간과 신장을 포함한 다른 기관에 독성을 유발하지 않음을 제시하고 있다. 따라서, 이러한 결과들은 EtSCT가 간질환과 피부노화의 우수한 보호제와 치료제로서의 가능성을 갖고 있음을 제시하고 있다.
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