피부자극성과 피부감작성의 평가는 화장품 원료의 안전성 평가에 필수적인 항목이다. 본 연구에서는 인체유래 피부각질세포로부터 3차원인공피부를 제조하고 이를 이용하여 피부자극성 동물대체시험법을 확립하였으며, 면역세포와 인공피부의 공동배양을 통해 피부감작성 평가의 툴로써 가능성을 탐색하였다. 인공피부 제조를 위하여 사람의 피부 조직으로부터 피부각질세포를 분리하고 확장시킨 후, 최적의 3차원 분화 배양 조건을 선정하였다. 제조된 인공피부는 조직학적 형태검사, 세포생존율 측정, 피부장벽 기능 측정, 각질층 내 지질의 분석, ...
피부자극성과 피부감작성의 평가는 화장품 원료의 안전성 평가에 필수적인 항목이다. 본 연구에서는 인체유래 피부각질세포로부터 3차원인공피부를 제조하고 이를 이용하여 피부자극성 동물대체시험법을 확립하였으며, 면역세포와 인공피부의 공동배양을 통해 피부감작성 평가의 툴로써 가능성을 탐색하였다. 인공피부 제조를 위하여 사람의 피부 조직으로부터 피부각질세포를 분리하고 확장시킨 후, 최적의 3차원 분화 배양 조건을 선정하였다. 제조된 인공피부는 조직학적 형태검사, 세포생존율 측정, 피부장벽 기능 측정, 각질층 내 지질의 분석, 염증성 사이토카인 분석을 실시하여 실제 인체 피부와의 유사성을 확인하였다. 조직학적 형태 검사 결과 인공피부에서 실제 피부와 마찬가지로 분화된 4개의 세포층이 관찰되었으며 각각의 피부 세포층에 따른 분화 표지자가 발현되고 있음을 확인하였다. 특히 기능적인 각질층을 형성하여 피부장벽 기능을 보유하고 있어 이를 이용한 in vitro 피부자극성 평가와 피부감작성 평가를 수행하였다. 인공피부를 이용한 피부자극시험은 시험물질을 인공피부에 도포하여 처치 후 인공피부의 세포생존율을 측정으로 피부자극성을 여부를 판별하였으며 최적 조건의 피부자극 시험법을 확립하기 위해 시험물질 적용량, 적용시간, 적용방법 및 세척방법에 대하여 다양한 조건으로 확인시험을 실시하였다. 피부자극성 평가의 국제 가이드라인 OECD TG 439에서 제시된 20종의 피부자극 표준물질을 대상으로 한 피부자극 시험에서 피부자극성 판별의 정확도는 물질의 UN GHS 분류와 비교하였을 때 민감도는 80%, 특이도는 70%로 전체적인 피부자극성의 예측력은 75%를 보였다. 이 수치는 OECD TG 439의 유사실시 기준에서 제시하고 있는 인공피부를 이용한 피부자극성 예측력 기준에 부합하는 수치이다. 인공피부를 이용한 피부감작시험은 기존의 인비트로 피부감작시험에 많은 연구가 진행된 human monocyte leukemia cell line인 THP-1 세포주와 인공피부를 공동배양 하여 감작물질이 피부를 통해 흡수되고 대사되어 면역세포에 전달되는 시스템을 모사하였다. THP-1 세포주의 표면 항원인 CD54, CD86의 활성화 정도를 측정하였으며 시험 물질은 세포의 IC50 농도를 산출하여 0.1×, 0.5×, 1×의 농도로 처치하였다. 감작물질 (1-Chloro-2,4-dinitrobenzene; Alpha-hexylcinnamaldehyde; Isoeugenol), 자극물질 (Sodium lauryl sulfate; Benzalkonium chloride), 비감작이며 비자극물질(Isopropanol; Glycerol)의 총 7종 시험 물질을 대상으로 한 피부감작 시험에서 자극원과 감작원을 확실히 구별해내지 못하는 THP-1 세포주 단독 시스템에 비하여 인공피부와 THP-1 세포주의 공동배양 시스템에서는 자극원의 위양성 판별이 개선되는 효과를 확인하였다. 이러한 결과는 피부자극, 피부감작 등 화장품의 안전성 평가의 동물대체 시험으로써 인공피부가 좋은 모델이 될 수 있음을 보여준다.
피부자극성과 피부감작성의 평가는 화장품 원료의 안전성 평가에 필수적인 항목이다. 본 연구에서는 인체유래 피부각질세포로부터 3차원 인공피부를 제조하고 이를 이용하여 피부자극성 동물대체시험법을 확립하였으며, 면역세포와 인공피부의 공동배양을 통해 피부감작성 평가의 툴로써 가능성을 탐색하였다. 인공피부 제조를 위하여 사람의 피부 조직으로부터 피부각질세포를 분리하고 확장시킨 후, 최적의 3차원 분화 배양 조건을 선정하였다. 제조된 인공피부는 조직학적 형태검사, 세포생존율 측정, 피부장벽 기능 측정, 각질층 내 지질의 분석, 염증성 사이토카인 분석을 실시하여 실제 인체 피부와의 유사성을 확인하였다. 조직학적 형태 검사 결과 인공피부에서 실제 피부와 마찬가지로 분화된 4개의 세포층이 관찰되었으며 각각의 피부 세포층에 따른 분화 표지자가 발현되고 있음을 확인하였다. 특히 기능적인 각질층을 형성하여 피부장벽 기능을 보유하고 있어 이를 이용한 in vitro 피부자극성 평가와 피부감작성 평가를 수행하였다. 인공피부를 이용한 피부자극시험은 시험물질을 인공피부에 도포하여 처치 후 인공피부의 세포생존율을 측정으로 피부자극성을 여부를 판별하였으며 최적 조건의 피부자극 시험법을 확립하기 위해 시험물질 적용량, 적용시간, 적용방법 및 세척방법에 대하여 다양한 조건으로 확인시험을 실시하였다. 피부자극성 평가의 국제 가이드라인 OECD TG 439에서 제시된 20종의 피부자극 표준물질을 대상으로 한 피부자극 시험에서 피부자극성 판별의 정확도는 물질의 UN GHS 분류와 비교하였을 때 민감도는 80%, 특이도는 70%로 전체적인 피부자극성의 예측력은 75%를 보였다. 이 수치는 OECD TG 439의 유사실시 기준에서 제시하고 있는 인공피부를 이용한 피부자극성 예측력 기준에 부합하는 수치이다. 인공피부를 이용한 피부감작시험은 기존의 인비트로 피부감작시험에 많은 연구가 진행된 human monocyte leukemia cell line인 THP-1 세포주와 인공피부를 공동배양 하여 감작물질이 피부를 통해 흡수되고 대사되어 면역세포에 전달되는 시스템을 모사하였다. THP-1 세포주의 표면 항원인 CD54, CD86의 활성화 정도를 측정하였으며 시험 물질은 세포의 IC50 농도를 산출하여 0.1×, 0.5×, 1×의 농도로 처치하였다. 감작물질 (1-Chloro-2,4-dinitrobenzene; Alpha-hexylcinnamaldehyde; Isoeugenol), 자극물질 (Sodium lauryl sulfate; Benzalkonium chloride), 비감작이며 비자극물질(Isopropanol; Glycerol)의 총 7종 시험 물질을 대상으로 한 피부감작 시험에서 자극원과 감작원을 확실히 구별해내지 못하는 THP-1 세포주 단독 시스템에 비하여 인공피부와 THP-1 세포주의 공동배양 시스템에서는 자극원의 위양성 판별이 개선되는 효과를 확인하였다. 이러한 결과는 피부자극, 피부감작 등 화장품의 안전성 평가의 동물대체 시험으로써 인공피부가 좋은 모델이 될 수 있음을 보여준다.
Testing for skin irritation and skin sensitization are essential aspects of the safety assessment of cosmetic ingredients. In this study, a three-dimensional human skin model was reconstructed from human-derived keratinocytes, and this was used to establish an alternative to animal testing for the e...
Testing for skin irritation and skin sensitization are essential aspects of the safety assessment of cosmetic ingredients. In this study, a three-dimensional human skin model was reconstructed from human-derived keratinocytes, and this was used to establish an alternative to animal testing for the evaluation of skin irritation. In addition, immune cells were co-cultured with the reconstructed human skin model in order to explore possibilities for use as a framework for testing skin sensitization. Keratinocytes were isolated and expanded from human skin tissue to reconstruct the human skin model and optimal three-dimensional tissue culture conditions were determined. The histological morphology, viability, skin barrier function, lipids profile within the stratum corneum and production of pro-inflammatory cytokines were analyzed in the reconstructed human skin model in order to determine its similarity to human skin. The histological morphology identified four differentiated cell layers the same as are present in normal human skin, and each layer expressed the expected differentiation markers. Furthermore, the reconstructed human skin model exhibited barrier function through the formation of a functional stratum corneum. It represent the possibility to be used for in vitro skin irritation and skin sensitization testing. For the skin irritation test, the reconstructed human skin model was treated with test materials, and the cell viability was measured in order to determine the degree of irritation. The amount, application time, application method, and washing method of the test materials was varied in order to establish the optimal conditions for the test. The accuracy of the skin irritation test was determined by using twenty different types of standard materials, as suggested by the OECD TG 439, the international guideline for skin irritation testing. These tests resulted in 80% sensitivity, 70% specificity, and 75% overall accuracy of skin irritation, compared with the UN GHS classification. These values were compatible with the criteria for skin irritation predictability using validated reference skin model (VRM), as suggested by performance standard data from the OECD TG 439. For skin sensitization testing using the skin equivalent, a THP-1 cell line, which is a human monocyte leukemia cell line previously used in in vitro skin sensitization tests, was used. Cells were co-cultured with the reconstructed human skin model, creating a system in which the sensitizers are absorbed to the skin, metabolized, and transported to immune cells, thus mimicking the in vivo situation. Test materials were used at concentrations of 0.1×, 0.5× and 1×, after calculating the IC50 concentration of the cells and activation levels of CD54 and CD86, surface antigens of the THP-1 cell line, were measured. In a skin sensitization test with seven different types of test materials, including sensitizers (1-Chloro-2,4-dinitrobenzene; Alpha-hexylcinnamaldehyde; Isoeugenol), irritants (Sodium lauryl sulfate; Benzalkonium chloride), and non-sensitive and non-irritants (Isopropanol; Glycerol), the co-culture system comprising the skin equivalent and the THP-1 cell line improved the false positive rate for irritants compared to that of the THP-1 cell line alone, which was unable to distinguish between irritants and sensitizers. These results suggest that the reconstructed human skin model is a promising model for assessing the safety of cosmetics for skin irritation and skin sensitization, it represents an alternative method to animal testing.
Testing for skin irritation and skin sensitization are essential aspects of the safety assessment of cosmetic ingredients. In this study, a three-dimensional human skin model was reconstructed from human-derived keratinocytes, and this was used to establish an alternative to animal testing for the evaluation of skin irritation. In addition, immune cells were co-cultured with the reconstructed human skin model in order to explore possibilities for use as a framework for testing skin sensitization. Keratinocytes were isolated and expanded from human skin tissue to reconstruct the human skin model and optimal three-dimensional tissue culture conditions were determined. The histological morphology, viability, skin barrier function, lipids profile within the stratum corneum and production of pro-inflammatory cytokines were analyzed in the reconstructed human skin model in order to determine its similarity to human skin. The histological morphology identified four differentiated cell layers the same as are present in normal human skin, and each layer expressed the expected differentiation markers. Furthermore, the reconstructed human skin model exhibited barrier function through the formation of a functional stratum corneum. It represent the possibility to be used for in vitro skin irritation and skin sensitization testing. For the skin irritation test, the reconstructed human skin model was treated with test materials, and the cell viability was measured in order to determine the degree of irritation. The amount, application time, application method, and washing method of the test materials was varied in order to establish the optimal conditions for the test. The accuracy of the skin irritation test was determined by using twenty different types of standard materials, as suggested by the OECD TG 439, the international guideline for skin irritation testing. These tests resulted in 80% sensitivity, 70% specificity, and 75% overall accuracy of skin irritation, compared with the UN GHS classification. These values were compatible with the criteria for skin irritation predictability using validated reference skin model (VRM), as suggested by performance standard data from the OECD TG 439. For skin sensitization testing using the skin equivalent, a THP-1 cell line, which is a human monocyte leukemia cell line previously used in in vitro skin sensitization tests, was used. Cells were co-cultured with the reconstructed human skin model, creating a system in which the sensitizers are absorbed to the skin, metabolized, and transported to immune cells, thus mimicking the in vivo situation. Test materials were used at concentrations of 0.1×, 0.5× and 1×, after calculating the IC50 concentration of the cells and activation levels of CD54 and CD86, surface antigens of the THP-1 cell line, were measured. In a skin sensitization test with seven different types of test materials, including sensitizers (1-Chloro-2,4-dinitrobenzene; Alpha-hexylcinnamaldehyde; Isoeugenol), irritants (Sodium lauryl sulfate; Benzalkonium chloride), and non-sensitive and non-irritants (Isopropanol; Glycerol), the co-culture system comprising the skin equivalent and the THP-1 cell line improved the false positive rate for irritants compared to that of the THP-1 cell line alone, which was unable to distinguish between irritants and sensitizers. These results suggest that the reconstructed human skin model is a promising model for assessing the safety of cosmetics for skin irritation and skin sensitization, it represents an alternative method to animal testing.
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