[학위논문]신경세포를 이용한 루게릭병 연관 FUS의 병리학적 메카니즘 연구 Studies on pathological mechanism of ALS (amyotrophic lateral sclerosis)-linked FUS using primary neuronal cells원문보기
RNA/DNA binding protein 인 FUS (Fused in sarcoma) 는 신경퇴행성질환인 근위축성 측삭경화증 (Amyothrophic lateral sclerosis)과 전측두엽성치매 (Frontotemproal dementia) 연관 유전자이다. 정상적인 FUS는 핵 내에 위치하지만 신경퇴행성 환자의 경우 세포질 밖에서 비정상적인 단백질 응축물의 형태로 스트레스 응집체와 존재한다. 하지만 이러한 스트레스 응집체와의 비정상적인 세포 내 위치와 병리학적 FUS와의 연관성에 대해 알려진 바가 없다. 따라서 이 논문에서는 비정상적인 FUS 단백질 응집체 형성에 기여하는 FUS domain을 분석하고, FUS 돌연변이와 정상 FUS를 비교하여 병리학적 메카니즘을 분석하였다. SYGQ 와 RGG1도메인이 없는 FUS와 SYGQ, ZnF, RGG3 도메인이 없는 FUS 돌연변이는 FUS-positive 스트레스 응집체를 형성하지 않은 반면, ...
RNA/DNA binding protein 인 FUS (Fused in sarcoma) 는 신경퇴행성질환인 근위축성 측삭경화증 (Amyothrophic lateral sclerosis)과 전측두엽성치매 (Frontotemproal dementia) 연관 유전자이다. 정상적인 FUS는 핵 내에 위치하지만 신경퇴행성 환자의 경우 세포질 밖에서 비정상적인 단백질 응축물의 형태로 스트레스 응집체와 존재한다. 하지만 이러한 스트레스 응집체와의 비정상적인 세포 내 위치와 병리학적 FUS와의 연관성에 대해 알려진 바가 없다. 따라서 이 논문에서는 비정상적인 FUS 단백질 응집체 형성에 기여하는 FUS domain을 분석하고, FUS 돌연변이와 정상 FUS를 비교하여 병리학적 메카니즘을 분석하였다. SYGQ 와 RGG1도메인이 없는 FUS와 SYGQ, ZnF, RGG3 도메인이 없는 FUS 돌연변이는 FUS-positive 스트레스 응집체를 형성하지 않은 반면, RRM 도메인이 없는 FUS의 경우 더 많은 응집체를 형성하였다. 또한 ALS-연관 FUS R521C가 protein arginine methyl transferase 1 (PRMT1)와 WT이나 P525L에 비해서 비정상적인 결합이 있음을 발견하였고 이런 비정상적인 결합은 RNA를 매게로 이루어진다는 것을 밝혔다. 과발현된 PRMT1은 FUS R521C로 인한 신경 퇴행성을 회복시켰으며 또한 PRMT1의 부재 시 신경돌기 구조의 감소를 증가 시킨 것을 확인 할 수 있었다. 또한 actin stabilizing protein으로 알려진 Nd1-L의 mRNA가 FUS-R521C-PRMT1 complex를 함께 이루고 있음을 알아내었으며. Nd1-L 과발현은 산화스트레스 상에서 FUS-R521C에 의해 짧아진 신경돌기들을 회복시켰다. ALS 연관 FUS(R521C) 는 산화스트레스 조건에서 스트레스 응집체와 함께 존재하며 이는 스트레스 제거 상황에서도 여전히 스트레스 응집체와 함께 FUS R521C가 남아있었다. 자가소화작용은 단백질 및 세포내 기관을 분해시키는 기작으로서 FUS R521C-positive 스트레스 응집체를 조절 가능한지 알아보았다. 자가소화작용을 rapamycin으로 활성화 시켰을 때 FUS-positive 스트레스 응집체가 감소하였고 이는 자가소화작용 의존적 방법으로 제거될 수 있었다. 따라서 이 연구를 통해 산화스트레스에서의 ALS-연관 FUS 돌연변이의 새로운 병리학적 메카니즘이 ALS 및 스트레스 응집체 연관 퇴행성 뇌질환 치료제 개발에 대한 기초단사를 제공할 수 있으리라 사료된다.
RNA/DNA binding protein 인 FUS (Fused in sarcoma) 는 신경퇴행성질환인 근위축성 측삭경화증 (Amyothrophic lateral sclerosis)과 전측두엽성치매 (Frontotemproal dementia) 연관 유전자이다. 정상적인 FUS는 핵 내에 위치하지만 신경퇴행성 환자의 경우 세포질 밖에서 비정상적인 단백질 응축물의 형태로 스트레스 응집체와 존재한다. 하지만 이러한 스트레스 응집체와의 비정상적인 세포 내 위치와 병리학적 FUS와의 연관성에 대해 알려진 바가 없다. 따라서 이 논문에서는 비정상적인 FUS 단백질 응집체 형성에 기여하는 FUS domain을 분석하고, FUS 돌연변이와 정상 FUS를 비교하여 병리학적 메카니즘을 분석하였다. SYGQ 와 RGG1도메인이 없는 FUS와 SYGQ, ZnF, RGG3 도메인이 없는 FUS 돌연변이는 FUS-positive 스트레스 응집체를 형성하지 않은 반면, RRM 도메인이 없는 FUS의 경우 더 많은 응집체를 형성하였다. 또한 ALS-연관 FUS R521C가 protein arginine methyl transferase 1 (PRMT1)와 WT이나 P525L에 비해서 비정상적인 결합이 있음을 발견하였고 이런 비정상적인 결합은 RNA를 매게로 이루어진다는 것을 밝혔다. 과발현된 PRMT1은 FUS R521C로 인한 신경 퇴행성을 회복시켰으며 또한 PRMT1의 부재 시 신경돌기 구조의 감소를 증가 시킨 것을 확인 할 수 있었다. 또한 actin stabilizing protein으로 알려진 Nd1-L의 mRNA가 FUS-R521C-PRMT1 complex를 함께 이루고 있음을 알아내었으며. Nd1-L 과발현은 산화스트레스 상에서 FUS-R521C에 의해 짧아진 신경돌기들을 회복시켰다. ALS 연관 FUS(R521C) 는 산화스트레스 조건에서 스트레스 응집체와 함께 존재하며 이는 스트레스 제거 상황에서도 여전히 스트레스 응집체와 함께 FUS R521C가 남아있었다. 자가소화작용은 단백질 및 세포내 기관을 분해시키는 기작으로서 FUS R521C-positive 스트레스 응집체를 조절 가능한지 알아보았다. 자가소화작용을 rapamycin으로 활성화 시켰을 때 FUS-positive 스트레스 응집체가 감소하였고 이는 자가소화작용 의존적 방법으로 제거될 수 있었다. 따라서 이 연구를 통해 산화스트레스에서의 ALS-연관 FUS 돌연변이의 새로운 병리학적 메카니즘이 ALS 및 스트레스 응집체 연관 퇴행성 뇌질환 치료제 개발에 대한 기초단사를 제공할 수 있으리라 사료된다.
Mutations in fused in Sarcoma (FUS) have been identified in patients with amytrophic lateral sclerosis (ALS) or frontotemporal Dementia (FTD). Pathological FUS is mis-localized to cytosol and forms aggregates associated with stress granules (SG), while FUS is normally localized to nucleus. However, ...
Mutations in fused in Sarcoma (FUS) have been identified in patients with amytrophic lateral sclerosis (ALS) or frontotemporal Dementia (FTD). Pathological FUS is mis-localized to cytosol and forms aggregates associated with stress granules (SG), while FUS is normally localized to nucleus. However, it is largely unknown about how pathological FUS forms SG-aggregate and which domains are responsible for this process. In this study, I examined cellular localization and aggregation of ALS-linked FUS missense mutants (P525L, R521C, R521H, R521G), analyzed the domains responsible for cytosolic FUS aggregation in HEK293T cells, and confirmed this in cultured mouse neurons. I also investigated whether ALS-causing mutations alter protein-protein and protein-RNA complexes and contribute to neurodegeneration. To do this, I firstly generated missense mutants of FUS and then examined their cellular localization. I found that cytosolic FUS without SYGQ and RGG1 domain or cytosolic FUS without RGG2-ZnF-RGG3 domain did not form FUS-positive SG aggregates, while cytosolic FUS without RRM domain generated more aggregates compared to FUS- Δ17. To further investigate FUS-mediated cellular pathogenic mechanism of ALS, I identified protein arginine methyl transferase 1 (PRMT1) as a protein that more avidly associates with ALS-linked FUS-R521C than with FUS-WT (wild type) or FUS-P525L using co-immunoprecipitation and LC-MS analysis. Abnormal association between FUS-R521C and PRMT1 requires RNA, but not methyl transferase activity. Overexpression of PRMT1 rescued neurite degeneration caused by FUS-R521C, while loss of PRMT1 further accumulated FUS-positive aggregates and enhanced neurite degeneration. I found that the mRNA of Nd1-L, an actin stabilizing protein, was sequestered into the FUS-R521C-PRMT1 complex. Nd1-L overexpression rescued neurite shortening caused by FUS-R521C upon oxidative stress, while loss of Nd1-L further exacerbated neurite shortening. I found that the ALS-linked FUS(R521C) mutation causes accumulation of FUS-positive SGs under oxidative stress, leading to a disruption in the release of FUS from SGs in cultured neurons. Autophagy controls the quality of proteins or organelles; therefore, I checked whether autophagy regulates FUS(R521C)-positive SGs. Autophagy activation with rapamycin reduced the accumulation of FUS-positive SGs in an autophagy-dependent manner. Rapamycin further reduced neurite fragmentation and cell death in neurons expressing mutant FUS under oxidative stress. Therefore, my studies will provide a novel pathogenic mechanism of ALS associated with a FUS mutation under oxidative stress, as well as therapeutic insight regarding FUS pathology associated with excessive SGs.
Mutations in fused in Sarcoma (FUS) have been identified in patients with amytrophic lateral sclerosis (ALS) or frontotemporal Dementia (FTD). Pathological FUS is mis-localized to cytosol and forms aggregates associated with stress granules (SG), while FUS is normally localized to nucleus. However, it is largely unknown about how pathological FUS forms SG-aggregate and which domains are responsible for this process. In this study, I examined cellular localization and aggregation of ALS-linked FUS missense mutants (P525L, R521C, R521H, R521G), analyzed the domains responsible for cytosolic FUS aggregation in HEK293T cells, and confirmed this in cultured mouse neurons. I also investigated whether ALS-causing mutations alter protein-protein and protein-RNA complexes and contribute to neurodegeneration. To do this, I firstly generated missense mutants of FUS and then examined their cellular localization. I found that cytosolic FUS without SYGQ and RGG1 domain or cytosolic FUS without RGG2-ZnF-RGG3 domain did not form FUS-positive SG aggregates, while cytosolic FUS without RRM domain generated more aggregates compared to FUS- Δ17. To further investigate FUS-mediated cellular pathogenic mechanism of ALS, I identified protein arginine methyl transferase 1 (PRMT1) as a protein that more avidly associates with ALS-linked FUS-R521C than with FUS-WT (wild type) or FUS-P525L using co-immunoprecipitation and LC-MS analysis. Abnormal association between FUS-R521C and PRMT1 requires RNA, but not methyl transferase activity. Overexpression of PRMT1 rescued neurite degeneration caused by FUS-R521C, while loss of PRMT1 further accumulated FUS-positive aggregates and enhanced neurite degeneration. I found that the mRNA of Nd1-L, an actin stabilizing protein, was sequestered into the FUS-R521C-PRMT1 complex. Nd1-L overexpression rescued neurite shortening caused by FUS-R521C upon oxidative stress, while loss of Nd1-L further exacerbated neurite shortening. I found that the ALS-linked FUS(R521C) mutation causes accumulation of FUS-positive SGs under oxidative stress, leading to a disruption in the release of FUS from SGs in cultured neurons. Autophagy controls the quality of proteins or organelles; therefore, I checked whether autophagy regulates FUS(R521C)-positive SGs. Autophagy activation with rapamycin reduced the accumulation of FUS-positive SGs in an autophagy-dependent manner. Rapamycin further reduced neurite fragmentation and cell death in neurons expressing mutant FUS under oxidative stress. Therefore, my studies will provide a novel pathogenic mechanism of ALS associated with a FUS mutation under oxidative stress, as well as therapeutic insight regarding FUS pathology associated with excessive SGs.
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