체내 배아 발달은 활성산소 (ROS)에 대한 효소 및 비효소적 산화방지시스템의 존재로 인해 해로운 영향을 많이 받지 않지만, 체외 배아의 경우 보호 시스템의 부재로 인해 ROS에 쉽게 영향을 받는다. 결과적으로 체외 배양 시스템에서 ROS를 보호하기 위하여 외부 항산화 인자가 필요하다. 본 연구에서는 ROS의 해로운 영향을 줄이기 위하여 서로 다른 2개의 항산화 인자인 Coagulasin-A (Coa-A)와 Polydatin (...
체내 배아 발달은 활성산소 (ROS)에 대한 효소 및 비효소적 산화방지시스템의 존재로 인해 해로운 영향을 많이 받지 않지만, 체외 배아의 경우 보호 시스템의 부재로 인해 ROS에 쉽게 영향을 받는다. 결과적으로 체외 배양 시스템에서 ROS를 보호하기 위하여 외부 항산화 인자가 필요하다. 본 연구에서는 ROS의 해로운 영향을 줄이기 위하여 서로 다른 2개의 항산화 인자인 Coagulasin-A (Coa-A)와 Polydatin (PD)을 이용하였다. Coa-A는 withanolide 부산물 중 하나로 steroidal lactone으로 부터 유래된 물질이다. Withanolid는 NF-κB를 억제하여 암세포화를 막아줄 뿐만 아니라 ROS에 대한 항산화 인자로도 사용된다. Coa-A (withanolide) 또한 cyclooxygenase (COX)-1, 2의 활성을 억제하여 염증반응을 줄여준다. PD는 레즈베라트롤의 천연 전구체로 항산화와 항염증, 항암을 포함하는 약학 작용을 한다. PD는 체, 내외 ROS의 생산을 줄여주며 cyclooxygenase (COX-2) 발현을 억제한다. 그러나 체외 배양액에 첨가되는 Coa-A와 PD는 소 배아의 발달에 미치는 영향을 밝혀지지 않았다. 우리는 처음으로 체외 배아 성숙 배양액에 Coa-A와 PD를 사용하였으며 배아 발달에 대한 의미 있는 결과를 아래와 같이 요약하였다. Chapter II 본 연구에서는 Coa-A가 체외에서의 소 난자 성숙 및 배아 발달에 영향에 대하여 조사하였다. 본 연구가 진행되는 과정에서 체외성숙 배양액 에 다양한 농도의 Coa-A (1, 2.5, 5, 7.5, 10 µM)를 첨가하였으며, 그 중 5 µM을 첨가하였을 때 8일 차 배반포 발달률이 대조군에 비하여 유의적으로 높음을 확인했다. 결과적으로 Coa-A의 농도를 5 µM로 결정하여 연구에 사용하였다. 5 µM Coa-A 처리군 배반포에서 유의적으로 HSP70 발현이 증가하고, NF-κB 발현이 낮아지는 것을 면역형광 분석을 통해 확인하였다. HSP70과 NF-κB는 RT-PCR을 통해서도 발현을 확인하였다. 추가적으로 TUNEL과 Hoechst 33342 염색을 통해서 Coa-A가 배반포의 총 세포 수 증가와 세포사멸 수 감소를 확인하였다. 결과적으로 체외성숙 배양액에 Coa-A를 첨가했을 때 배반포의 질과 발달률이 향상이 된다는 것을 HSP70의 증가와 NF-κB 억제를 통하여 확인되었다. Chapter III Heat stress는 소의 착상율을 포함한 번식에 큰 영향을 미친다. 본 연구에서 우리는 체외에서의 소 배아 생산 기간 동안 Coa-A 첨가시 배아의 온도 저항성에 대하여 실험을 하였다. 우리는 40.5 ℃와 42 ℃조건으로 20시간 동안 체외배양을 하였다. 그 중 Coa-A를 첨가 후 40.5℃조건으로 배양한 그룹에서만 배반포 발달률이 유의적으로 증가하였다 (P < 0.05). 단백질 발현의 경우 5 µM의 Coa-A를 첨가하였을 때 대조군에 비해 HSP70과 PI3K의 경우 유의적으로 증가하였고, NF-κB와 COX2는 감소하였다. 전사와 관련된 유전자의 발현 패턴을 확인하기 위하여 qRT-PCR을 실시한 결과, Coa-A 처리군이 대조군에 비하여 HSP70, PI3K는 발현이 증가하였으며, NF-κB, COX2, inducible nitric oxide synthase (iNOS)는 유의적으로 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 더욱이 세포사 유발 유전자 발현은 감소하였고, 항세포사 유전자 발현은 증가하였다. 또한, 대조군에 비하여 Coa-A 처리군의 경우 배반포에서 총 세포 수가 증가하고, 사멸세포 수가 감소하는 것을 확인하였다. 결과적으로 Coa-A는 배반포의 체외발달 향상은 물론 HSP70 및 PI1K의 발현 증가를 통해 heat stress의 저항성이 증가시킨다. Chapter IV 본 연구는 일반적 체외 배양 온도 (38.5℃)에서 PD의 이로운 영향을 밝히기 위해 수행되었다. 우리는 체외성숙 배양액에 PD를 다양한 농도 (0.5, 1, 2 µM)로 첨가하였으며, 그 중 1 µM에서 배반포 발달이 유의적으로 높게 나타나는 것을 확인했다. 면역형광 분석결과 PD 처리군이 대조군에 비하여 Sirt 1의 발현은 유의적으로 높게, ROS (8-OxoG), COX-2, NF-κB의 발현은 유의적으로 낮게 발현되었다 (P < 0.05). Sirt 1, NF-κB, COX-2, iNOS는 RT-PCR을 통해서도 발현을 확인하였다. 더욱이 PD 처리군에서 BAX 발현이 약한 것을 확인하였다. 그리고 TUNEL과 Hoechst 33342 염색을 통하여 PD 처리군의 배반포 질 향상을 확인하였다. 우리는 체외성숙 배양액에 PD를 첨가하면 배반포 발달이 향상되는 것을 Sirt 1을 통해 확인하였다. General conclusion 결과적으로 본 연구는 체외성숙 배양액에 항산화제 (Coa-A, PD)를 첨가가 소 배아의 발달과 질을 향상시키는 것을 확인하였다. 항산화제는 스트레스와 생존, 항세포사와 관련된 유전자의 발현을 증가시키는 반면 ROS를 줄여준다.
체내 배아 발달은 활성산소 (ROS)에 대한 효소 및 비효소적 산화방지시스템의 존재로 인해 해로운 영향을 많이 받지 않지만, 체외 배아의 경우 보호 시스템의 부재로 인해 ROS에 쉽게 영향을 받는다. 결과적으로 체외 배양 시스템에서 ROS를 보호하기 위하여 외부 항산화 인자가 필요하다. 본 연구에서는 ROS의 해로운 영향을 줄이기 위하여 서로 다른 2개의 항산화 인자인 Coagulasin-A (Coa-A)와 Polydatin (PD)을 이용하였다. Coa-A는 withanolide 부산물 중 하나로 steroidal lactone으로 부터 유래된 물질이다. Withanolid는 NF-κB를 억제하여 암세포화를 막아줄 뿐만 아니라 ROS에 대한 항산화 인자로도 사용된다. Coa-A (withanolide) 또한 cyclooxygenase (COX)-1, 2의 활성을 억제하여 염증반응을 줄여준다. PD는 레즈베라트롤의 천연 전구체로 항산화와 항염증, 항암을 포함하는 약학 작용을 한다. PD는 체, 내외 ROS의 생산을 줄여주며 cyclooxygenase (COX-2) 발현을 억제한다. 그러나 체외 배양액에 첨가되는 Coa-A와 PD는 소 배아의 발달에 미치는 영향을 밝혀지지 않았다. 우리는 처음으로 체외 배아 성숙 배양액에 Coa-A와 PD를 사용하였으며 배아 발달에 대한 의미 있는 결과를 아래와 같이 요약하였다. Chapter II 본 연구에서는 Coa-A가 체외에서의 소 난자 성숙 및 배아 발달에 영향에 대하여 조사하였다. 본 연구가 진행되는 과정에서 체외성숙 배양액 에 다양한 농도의 Coa-A (1, 2.5, 5, 7.5, 10 µM)를 첨가하였으며, 그 중 5 µM을 첨가하였을 때 8일 차 배반포 발달률이 대조군에 비하여 유의적으로 높음을 확인했다. 결과적으로 Coa-A의 농도를 5 µM로 결정하여 연구에 사용하였다. 5 µM Coa-A 처리군 배반포에서 유의적으로 HSP70 발현이 증가하고, NF-κB 발현이 낮아지는 것을 면역형광 분석을 통해 확인하였다. HSP70과 NF-κB는 RT-PCR을 통해서도 발현을 확인하였다. 추가적으로 TUNEL과 Hoechst 33342 염색을 통해서 Coa-A가 배반포의 총 세포 수 증가와 세포사멸 수 감소를 확인하였다. 결과적으로 체외성숙 배양액에 Coa-A를 첨가했을 때 배반포의 질과 발달률이 향상이 된다는 것을 HSP70의 증가와 NF-κB 억제를 통하여 확인되었다. Chapter III Heat stress는 소의 착상율을 포함한 번식에 큰 영향을 미친다. 본 연구에서 우리는 체외에서의 소 배아 생산 기간 동안 Coa-A 첨가시 배아의 온도 저항성에 대하여 실험을 하였다. 우리는 40.5 ℃와 42 ℃조건으로 20시간 동안 체외배양을 하였다. 그 중 Coa-A를 첨가 후 40.5℃조건으로 배양한 그룹에서만 배반포 발달률이 유의적으로 증가하였다 (P < 0.05). 단백질 발현의 경우 5 µM의 Coa-A를 첨가하였을 때 대조군에 비해 HSP70과 PI3K의 경우 유의적으로 증가하였고, NF-κB와 COX2는 감소하였다. 전사와 관련된 유전자의 발현 패턴을 확인하기 위하여 qRT-PCR을 실시한 결과, Coa-A 처리군이 대조군에 비하여 HSP70, PI3K는 발현이 증가하였으며, NF-κB, COX2, inducible nitric oxide synthase (iNOS)는 유의적으로 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 더욱이 세포사 유발 유전자 발현은 감소하였고, 항세포사 유전자 발현은 증가하였다. 또한, 대조군에 비하여 Coa-A 처리군의 경우 배반포에서 총 세포 수가 증가하고, 사멸세포 수가 감소하는 것을 확인하였다. 결과적으로 Coa-A는 배반포의 체외발달 향상은 물론 HSP70 및 PI1K의 발현 증가를 통해 heat stress의 저항성이 증가시킨다. Chapter IV 본 연구는 일반적 체외 배양 온도 (38.5℃)에서 PD의 이로운 영향을 밝히기 위해 수행되었다. 우리는 체외성숙 배양액에 PD를 다양한 농도 (0.5, 1, 2 µM)로 첨가하였으며, 그 중 1 µM에서 배반포 발달이 유의적으로 높게 나타나는 것을 확인했다. 면역형광 분석결과 PD 처리군이 대조군에 비하여 Sirt 1의 발현은 유의적으로 높게, ROS (8-OxoG), COX-2, NF-κB의 발현은 유의적으로 낮게 발현되었다 (P < 0.05). Sirt 1, NF-κB, COX-2, iNOS는 RT-PCR을 통해서도 발현을 확인하였다. 더욱이 PD 처리군에서 BAX 발현이 약한 것을 확인하였다. 그리고 TUNEL과 Hoechst 33342 염색을 통하여 PD 처리군의 배반포 질 향상을 확인하였다. 우리는 체외성숙 배양액에 PD를 첨가하면 배반포 발달이 향상되는 것을 Sirt 1을 통해 확인하였다. General conclusion 결과적으로 본 연구는 체외성숙 배양액에 항산화제 (Coa-A, PD)를 첨가가 소 배아의 발달과 질을 향상시키는 것을 확인하였다. 항산화제는 스트레스와 생존, 항세포사와 관련된 유전자의 발현을 증가시키는 반면 ROS를 줄여준다.
In vivo embryo development is well protected against the deleterious effect of reactive oxygen species (ROS) due to the presence of enzymatic and non-enzymatic antioxidants systems, in contracts in vitro such protective systems are absent and in vitro embryos are susceptible to the ROS. Therefore in...
In vivo embryo development is well protected against the deleterious effect of reactive oxygen species (ROS) due to the presence of enzymatic and non-enzymatic antioxidants systems, in contracts in vitro such protective systems are absent and in vitro embryos are susceptible to the ROS. Therefore in vitro system the external source of antioxidants is needed for embryo development and protection against ROS. In the present study two different antioxidant compounds, Coagulansin-A (Coa-A) and Polydatin (PD), are used to reduce the adverse effect of ROS. Coa-A is one of the withanolide derivative which is steroidal lactone. Withanolides prevent tumoroigenesis by inhibiting NF-kB and can be also used as an antioxidant against ROS. Coa-A (withanolide) also inhibits the activities of cyclooxygenase (COX)-1 and -2 and reduces inflammation. PD is the natural precursor of resveratrol, having various pharmacological activities including antioxidant, anti-inflammatory and anticancer. PD reduces the ROS production and suppresses cyclooxygenase (COX-2) expression in vitro and in vivo. However the effect of Coa-A and PD supplemented in vitro media on the developmental competence of bovine embryo is unknown. We used Coa-A and PD for the first time in vitro maturation media and found the valuable results regarding embryo development which are summarized below: Chapter II This study investigated the effects of Coa-A on bovine oocyte maturation and embryo development in vitro. During this study in vitro maturation medium was supplemented with various concentration of Coa-A (1, 2.5, 5, 7.5 and 10 µM) and we found that the 5 µM significantly (P < 0.05) improve the blastocyst (Day 8 blastocyst) development comparing to the control untreated group. Therefore, this concentration of Coa-A was used in the subsequent experiment. Treatment with 5 µM Coa-A significantly induce the HSP70 and reduce the expression of NF-kB conformed through Immunofluorescence analysis. The expressions of HSP70 and NF-kB were also conformed through RT-PCR. Additionally, the TUNEL assay and Hoechst 33342 staining conformed that the Coa-A improve the blastocyst quality by decreasing the apoptotic cells while increasing the total number of cells respectively. In conclusion the Coa-A supplemented in IVM media improve the blastocyst quality and development through the induction of HSP70 and down regulation of NF-kB. Chapter III Heat stress has large effects on reproduction including conception rate in cattle. In this study, we examined the effects of Coa-A on acquired thermo tolerance during in vitro production of bovine embryos. During in vitro maturation stage we used two different temperatures 40.5℃ and 42℃, for 20 h. The treatment of Coa-A significantly improved blastocyst development only at 40.5℃ (P < 0.05). The protein expression of HSP70 and PI3K was significantly induced by 5 µM of Coa-A while those of NF-kB and COX2 was reduced comparing to control group. To determine the expression patterns of related genes at the transcription level, qRT-PCR was performed, expression of HSP70 and PI3K was high while expression of NF-kB, COX2, and inducible nitric oxide synthase (iNOS) was significantly (P <0.05) down-regulated in the Coa-A treated group compared with the control group. Moreover, proapoptotic genes were down-regulated, and antiapoptic genes were up-regulated in the Coa-A group. The Coa-A also improve the blastocyst quality by increasing the total cells number while decreasing the apoptotic cells number comparing to the control untreated group. In conclusion, our results demonstrate that the Coa-A not only improved the blastocyst development in vitro, but also increased their resistance to heat stress condition through induction of HSP70/PI3K. Chapter IV The aim of this study was to investigate the beneficial effect of PD on in vitro development of bovine embryo at normal culture temperature (38.5℃). Among the various concentrations of PD (0.5, 1, and 2 µM) added to in vitro maturation medium, only 1 µM PD significantly improved blastocyst development. Immunofluorescence analysis shows that PD treatment significantly (P < 0.05) induce the expression of Sirt 1 while reduce the expression of ROS (8-OxoG), COX-2 and NF-kB comparing to the control untreated group. The expression of Sirt 1, NF-kB, COX-2 and iNOS was also conformed through RT-PCR which supports the immunofluorescence analysis. Moreover PD significantly attenuated the expression of BAX comparing to the control untreated group. The blastocyst quality was improved by PD, conformed by TUNEL and Hoechst 33342 staining. We concluded that the supplementation of in vitro maturation medium with PD improved the embryo developmental competence via Sirt 1. General conclusion In conclusion, the present study demonstrated that supplementation of in vitro maturation medium with antioxidants (Coa-A and PD) enhances the developmental competence and quality of bovine embryos. These antioxidants exert their effects via increasing the expression of stress, survival and anti-apoptotic related genes while reducing the ROS.
In vivo embryo development is well protected against the deleterious effect of reactive oxygen species (ROS) due to the presence of enzymatic and non-enzymatic antioxidants systems, in contracts in vitro such protective systems are absent and in vitro embryos are susceptible to the ROS. Therefore in vitro system the external source of antioxidants is needed for embryo development and protection against ROS. In the present study two different antioxidant compounds, Coagulansin-A (Coa-A) and Polydatin (PD), are used to reduce the adverse effect of ROS. Coa-A is one of the withanolide derivative which is steroidal lactone. Withanolides prevent tumoroigenesis by inhibiting NF-kB and can be also used as an antioxidant against ROS. Coa-A (withanolide) also inhibits the activities of cyclooxygenase (COX)-1 and -2 and reduces inflammation. PD is the natural precursor of resveratrol, having various pharmacological activities including antioxidant, anti-inflammatory and anticancer. PD reduces the ROS production and suppresses cyclooxygenase (COX-2) expression in vitro and in vivo. However the effect of Coa-A and PD supplemented in vitro media on the developmental competence of bovine embryo is unknown. We used Coa-A and PD for the first time in vitro maturation media and found the valuable results regarding embryo development which are summarized below: Chapter II This study investigated the effects of Coa-A on bovine oocyte maturation and embryo development in vitro. During this study in vitro maturation medium was supplemented with various concentration of Coa-A (1, 2.5, 5, 7.5 and 10 µM) and we found that the 5 µM significantly (P < 0.05) improve the blastocyst (Day 8 blastocyst) development comparing to the control untreated group. Therefore, this concentration of Coa-A was used in the subsequent experiment. Treatment with 5 µM Coa-A significantly induce the HSP70 and reduce the expression of NF-kB conformed through Immunofluorescence analysis. The expressions of HSP70 and NF-kB were also conformed through RT-PCR. Additionally, the TUNEL assay and Hoechst 33342 staining conformed that the Coa-A improve the blastocyst quality by decreasing the apoptotic cells while increasing the total number of cells respectively. In conclusion the Coa-A supplemented in IVM media improve the blastocyst quality and development through the induction of HSP70 and down regulation of NF-kB. Chapter III Heat stress has large effects on reproduction including conception rate in cattle. In this study, we examined the effects of Coa-A on acquired thermo tolerance during in vitro production of bovine embryos. During in vitro maturation stage we used two different temperatures 40.5℃ and 42℃, for 20 h. The treatment of Coa-A significantly improved blastocyst development only at 40.5℃ (P < 0.05). The protein expression of HSP70 and PI3K was significantly induced by 5 µM of Coa-A while those of NF-kB and COX2 was reduced comparing to control group. To determine the expression patterns of related genes at the transcription level, qRT-PCR was performed, expression of HSP70 and PI3K was high while expression of NF-kB, COX2, and inducible nitric oxide synthase (iNOS) was significantly (P <0.05) down-regulated in the Coa-A treated group compared with the control group. Moreover, proapoptotic genes were down-regulated, and antiapoptic genes were up-regulated in the Coa-A group. The Coa-A also improve the blastocyst quality by increasing the total cells number while decreasing the apoptotic cells number comparing to the control untreated group. In conclusion, our results demonstrate that the Coa-A not only improved the blastocyst development in vitro, but also increased their resistance to heat stress condition through induction of HSP70/PI3K. Chapter IV The aim of this study was to investigate the beneficial effect of PD on in vitro development of bovine embryo at normal culture temperature (38.5℃). Among the various concentrations of PD (0.5, 1, and 2 µM) added to in vitro maturation medium, only 1 µM PD significantly improved blastocyst development. Immunofluorescence analysis shows that PD treatment significantly (P < 0.05) induce the expression of Sirt 1 while reduce the expression of ROS (8-OxoG), COX-2 and NF-kB comparing to the control untreated group. The expression of Sirt 1, NF-kB, COX-2 and iNOS was also conformed through RT-PCR which supports the immunofluorescence analysis. Moreover PD significantly attenuated the expression of BAX comparing to the control untreated group. The blastocyst quality was improved by PD, conformed by TUNEL and Hoechst 33342 staining. We concluded that the supplementation of in vitro maturation medium with PD improved the embryo developmental competence via Sirt 1. General conclusion In conclusion, the present study demonstrated that supplementation of in vitro maturation medium with antioxidants (Coa-A and PD) enhances the developmental competence and quality of bovine embryos. These antioxidants exert their effects via increasing the expression of stress, survival and anti-apoptotic related genes while reducing the ROS.
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