산양삼 내생진균의 생물학적 다양성 및 이를 이용한 산양삼 병원균 친환경 방제기술 개발 Biodiversity of fungal endophytes in mountain cultivated ginseng (Panax ginseng Meyer) and their biocontrol activity against ginseng pathogens원문보기
내생미생물(endophyte)은 다양한 스트레스로부터 식물을 보호하는 역할이 있다고 알려져 있다. 하지만 중요 약용식물인 산양삼의 내생미생물에 관한 연구는 거의 전무하다. 우리나라 자생 산양삼으로부터 내생미생물을 분리하여 산양삼 재배시 대규모 피해를 주는 주요 산양삼 병원균의 활성을 억제하는 내생미생물을 이용하여 산양삼 병원균의 방제제 및 임지내에서 항균활성효과를 증대 시킬 수 있는 친환경 방제 기술 개발이 필요하다. 이를 위해 전국 9개 도, 24지역, 240개 산양삼의 여러 조직(뿌리, 잎, 줄기)에서 1,300개의 내생진균을 분리하였고, 분자생물학적 방법을 통해 129개의 내생진균을 최종적으로 동정하였다. 이들 내생진균은 각각 Ascomycota (81.7%), Basidiomycota (7.08%), Zygomycota (10%), unknown (1.15%) phylum에 속하였으며, 59개의 genera로 분류되었다. 실험에 사용된 산양삼의 재배지 특성에 따른 내생진균의 생물학적 다양성은 서로 상관관계에 있지 않았으며, 조직에 따른 ...
내생미생물(endophyte)은 다양한 스트레스로부터 식물을 보호하는 역할이 있다고 알려져 있다. 하지만 중요 약용식물인 산양삼의 내생미생물에 관한 연구는 거의 전무하다. 우리나라 자생 산양삼으로부터 내생미생물을 분리하여 산양삼 재배시 대규모 피해를 주는 주요 산양삼 병원균의 활성을 억제하는 내생미생물을 이용하여 산양삼 병원균의 방제제 및 임지내에서 항균활성효과를 증대 시킬 수 있는 친환경 방제 기술 개발이 필요하다. 이를 위해 전국 9개 도, 24지역, 240개 산양삼의 여러 조직(뿌리, 잎, 줄기)에서 1,300개의 내생진균을 분리하였고, 분자생물학적 방법을 통해 129개의 내생진균을 최종적으로 동정하였다. 이들 내생진균은 각각 Ascomycota (81.7%), Basidiomycota (7.08%), Zygomycota (10%), unknown (1.15%) phylum에 속하였으며, 59개의 genera로 분류되었다. 실험에 사용된 산양삼의 재배지 특성에 따른 내생진균의 생물학적 다양성은 서로 상관관계에 있지 않았으며, 조직에 따른 특이성은 발견되었다. 대부분의 내생진균은 산양삼의 뿌리에서 분리되었으며, 뿌리에서의 생물학적 다양성은 줄기나 잎에서보다 높았다. 또한 이들의 주요 산양삼 병원균(Alternaria panax, Botrytis cinerea, Cylindrocarpon destructans, Phytophthora cactorum, Rhizoctonia solani, Pythium sp.)에 대한 항균활성을 검정하기 위해 EtOAC 추출물, dual culture 실험을 진행한 결과, EtOAC 추출물에서는 Trichoderma polysporum, dual culture에서는 Trichoderma citrinoviride PG87의 활성이 가장 좋았다. 산양삼 방제기술 개발이라는 목적의 취지하에 dual culture를 이용한 결과가 적용 가능성이 높다고 판단하여 최종적으로 Trichoderma citrinoviride PG87를 선택하여 이후 실험을 진행하였다. 그 결과, Trichoderma citrinoviride PG87의 높은 cellulose분해효소(endo-1,4-β-D-glucanase, exo-1,4-β-D-glucanase, β-Glucosidases, β-1,3-glucanases)활성을 확인하고, 이를 통해 dual culture실험에서 병원균들에 대한 mycoparasitism 및 B. cinerea의 생장관련 유전자들의 발현감소를 확인하였다. 정령화 실험을 통해 인삼에 전처리 후 4주에서 약 5.4%의 군집도를 보였으며 지상부와 지하부에서 높은 방어기작 유전자 및 사포닌합성 유전자(FPS, SS, SE, DS, PPDS, PPTS)의 발현을 유도하였고 호르몬(ZA, ABA, JA)함량 또한 증가하였다. 결과적으로 특정 인삼 사포닌 Rb2, Rc, Re, Rg1 함량이 증가하였고 총 함량은 1.6배 증가하였다. B. cinerea의 접종 실험들에서도 높은 항균활성을 보였고 C. destructans의 접종 실험에서도 병증을 현저히 감소시켰으며 C. destructans 정량화의 경우 5.8%에서 0.35%로 대조군과 큰 차이를 보였다. 최종적으로 Trichoderma citrinoviride PG87의 제제화를 통해 분제와 입제를 개발하였고, 이들의 균생존성과 물리성을 확인하여 안정성을 고려하였다. 안전성 및 무해성이 입증된 분제와 입제를 실제 산양삼 재배지에 처리하여 이전과 같은 실험들을 반복하였다. 그 결과, 입제 및 분제의 처리는 Alternaria panax의 병증을 현저히 감소시켰으며, 정량화를 통해 Trichoderma citrinoviride PG87의 안정적인 군집도를 확인하였다. 또한 기내 시험과 유사한 방어기작 및 사포닌합성 유전자의 높은 발현과 증가된 호르몬의 함량을 확인하였다. 이는 실제 인삼사포닌 분석시험에서 인삼 사포닌 Rb1, Rb2, Rc, Re, Rg1 함량을 증가시켰으며 총 함량은 약 2배 가량 증가시켰다. 이러한 결과는 Trichoderma citrinoviride PG87의 제제를 이용하여 친환경적인 산양삼의 병원균 방제효과를 기대할 수 있을 뿐 아니라, 인삼 사포닌의 함량을 증가시켜 종합적으로 산양삼 자체의 품질 또한 증가시킬 수 있는 기대효과를 가진다.
내생미생물(endophyte)은 다양한 스트레스로부터 식물을 보호하는 역할이 있다고 알려져 있다. 하지만 중요 약용식물인 산양삼의 내생미생물에 관한 연구는 거의 전무하다. 우리나라 자생 산양삼으로부터 내생미생물을 분리하여 산양삼 재배시 대규모 피해를 주는 주요 산양삼 병원균의 활성을 억제하는 내생미생물을 이용하여 산양삼 병원균의 방제제 및 임지내에서 항균활성효과를 증대 시킬 수 있는 친환경 방제 기술 개발이 필요하다. 이를 위해 전국 9개 도, 24지역, 240개 산양삼의 여러 조직(뿌리, 잎, 줄기)에서 1,300개의 내생진균을 분리하였고, 분자생물학적 방법을 통해 129개의 내생진균을 최종적으로 동정하였다. 이들 내생진균은 각각 Ascomycota (81.7%), Basidiomycota (7.08%), Zygomycota (10%), unknown (1.15%) phylum에 속하였으며, 59개의 genera로 분류되었다. 실험에 사용된 산양삼의 재배지 특성에 따른 내생진균의 생물학적 다양성은 서로 상관관계에 있지 않았으며, 조직에 따른 특이성은 발견되었다. 대부분의 내생진균은 산양삼의 뿌리에서 분리되었으며, 뿌리에서의 생물학적 다양성은 줄기나 잎에서보다 높았다. 또한 이들의 주요 산양삼 병원균(Alternaria panax, Botrytis cinerea, Cylindrocarpon destructans, Phytophthora cactorum, Rhizoctonia solani, Pythium sp.)에 대한 항균활성을 검정하기 위해 EtOAC 추출물, dual culture 실험을 진행한 결과, EtOAC 추출물에서는 Trichoderma polysporum, dual culture에서는 Trichoderma citrinoviride PG87의 활성이 가장 좋았다. 산양삼 방제기술 개발이라는 목적의 취지하에 dual culture를 이용한 결과가 적용 가능성이 높다고 판단하여 최종적으로 Trichoderma citrinoviride PG87를 선택하여 이후 실험을 진행하였다. 그 결과, Trichoderma citrinoviride PG87의 높은 cellulose분해효소(endo-1,4-β-D-glucanase, exo-1,4-β-D-glucanase, β-Glucosidases, β-1,3-glucanases)활성을 확인하고, 이를 통해 dual culture실험에서 병원균들에 대한 mycoparasitism 및 B. cinerea의 생장관련 유전자들의 발현감소를 확인하였다. 정령화 실험을 통해 인삼에 전처리 후 4주에서 약 5.4%의 군집도를 보였으며 지상부와 지하부에서 높은 방어기작 유전자 및 사포닌합성 유전자(FPS, SS, SE, DS, PPDS, PPTS)의 발현을 유도하였고 호르몬(ZA, ABA, JA)함량 또한 증가하였다. 결과적으로 특정 인삼 사포닌 Rb2, Rc, Re, Rg1 함량이 증가하였고 총 함량은 1.6배 증가하였다. B. cinerea의 접종 실험들에서도 높은 항균활성을 보였고 C. destructans의 접종 실험에서도 병증을 현저히 감소시켰으며 C. destructans 정량화의 경우 5.8%에서 0.35%로 대조군과 큰 차이를 보였다. 최종적으로 Trichoderma citrinoviride PG87의 제제화를 통해 분제와 입제를 개발하였고, 이들의 균생존성과 물리성을 확인하여 안정성을 고려하였다. 안전성 및 무해성이 입증된 분제와 입제를 실제 산양삼 재배지에 처리하여 이전과 같은 실험들을 반복하였다. 그 결과, 입제 및 분제의 처리는 Alternaria panax의 병증을 현저히 감소시켰으며, 정량화를 통해 Trichoderma citrinoviride PG87의 안정적인 군집도를 확인하였다. 또한 기내 시험과 유사한 방어기작 및 사포닌합성 유전자의 높은 발현과 증가된 호르몬의 함량을 확인하였다. 이는 실제 인삼사포닌 분석시험에서 인삼 사포닌 Rb1, Rb2, Rc, Re, Rg1 함량을 증가시켰으며 총 함량은 약 2배 가량 증가시켰다. 이러한 결과는 Trichoderma citrinoviride PG87의 제제를 이용하여 친환경적인 산양삼의 병원균 방제효과를 기대할 수 있을 뿐 아니라, 인삼 사포닌의 함량을 증가시켜 종합적으로 산양삼 자체의 품질 또한 증가시킬 수 있는 기대효과를 가진다.
Diverse fungal endophytes isolated from mountain cultivated ginseng (MCG, Panax ginseng Meyer), a traditional medicinal plant, were explored for their diversity and investigated their potentially biocontrol activity against ginseng pathogens Alternaria panax, Botrytis cinerea, Cylindrocarpon destruc...
Diverse fungal endophytes isolated from mountain cultivated ginseng (MCG, Panax ginseng Meyer), a traditional medicinal plant, were explored for their diversity and investigated their potentially biocontrol activity against ginseng pathogens Alternaria panax, Botrytis cinerea, Cylindrocarpon destructans, Pythium sp. and Rhizoctonia solani. A total of 1,300 fungal endophytes were isolated from disease-free and surface sterilised plant segments (root, stem and leaf) from MCGs grown in 24 different geographic sites. 129 fungal isolates were authenticated by molecular identification based on rDNA ITS sequence analysis. The fungal endophytes belonged to Ascomycota (81.7%), Basidiomycota (7.08%), Zygomycota (10%) and unknown (1.15%), and classified to 59 genera. Analysis of diversity indices across sampling sites suggested species abundance as a function of geographical and environmental factors of the locations. Assessment of 129 fungal isolates for their biocontrol traits to 6 ginseng pathogen showed that ethyl acetate extract of T. polysporum demonstrated the highest activity against all pathogen. In contrast, T. citrinoviride showed antagonistic activity with mycoparasitism by means coiling around hyphae and penetration against all ginseng pathogens. We found that T. citrinoviride produced highest activity of endo-1, 4-β-D-glucanase, and it caused down-regulation of B. cinerea genes related in growth and virulence (BCG1, BAC, BOT1, PKA1 and TRE1). Inoculation of ginseng plants with T. citrinoviride by dipping inducted ginseng PR genes (PR2, PR3, PR4, PR5, PR6 and PR10) and ginsenoside biosynthetic genes (FPS, SS, SE, DS and PPDS), and also hormone levels (ZA, ABA and JA). The ginsenosides (Rb2, Rc, Re and Rg1) also increased after inoculation of T. citrinoviride. By the real-time PCR quantification of T. citrinoviride, successful endophytism was confirmed. In planta assay, T. citrinoviride inoculation significantly reduced the disease caused by B. cinera and C. destructans in ginseng plants. With this biocontol potential, we developed formulation agents as DP and GR which have been considered to convenience and stability, and those agents were also showed biocontrol activity on B. cinera and C. destructans with ginseng plants. Inoculation of MCG plants with DP and GR by foliar application enhanced disease resistance and gisenoside concentration (Rb1, Rb2, Rc, Re and Rg1) in field tests. These results indicate that T. citrinoviride is a beneficial endophyte with biocontrol properties, and it can increase the quality and yield of MCG plant.
Diverse fungal endophytes isolated from mountain cultivated ginseng (MCG, Panax ginseng Meyer), a traditional medicinal plant, were explored for their diversity and investigated their potentially biocontrol activity against ginseng pathogens Alternaria panax, Botrytis cinerea, Cylindrocarpon destructans, Pythium sp. and Rhizoctonia solani. A total of 1,300 fungal endophytes were isolated from disease-free and surface sterilised plant segments (root, stem and leaf) from MCGs grown in 24 different geographic sites. 129 fungal isolates were authenticated by molecular identification based on rDNA ITS sequence analysis. The fungal endophytes belonged to Ascomycota (81.7%), Basidiomycota (7.08%), Zygomycota (10%) and unknown (1.15%), and classified to 59 genera. Analysis of diversity indices across sampling sites suggested species abundance as a function of geographical and environmental factors of the locations. Assessment of 129 fungal isolates for their biocontrol traits to 6 ginseng pathogen showed that ethyl acetate extract of T. polysporum demonstrated the highest activity against all pathogen. In contrast, T. citrinoviride showed antagonistic activity with mycoparasitism by means coiling around hyphae and penetration against all ginseng pathogens. We found that T. citrinoviride produced highest activity of endo-1, 4-β-D-glucanase, and it caused down-regulation of B. cinerea genes related in growth and virulence (BCG1, BAC, BOT1, PKA1 and TRE1). Inoculation of ginseng plants with T. citrinoviride by dipping inducted ginseng PR genes (PR2, PR3, PR4, PR5, PR6 and PR10) and ginsenoside biosynthetic genes (FPS, SS, SE, DS and PPDS), and also hormone levels (ZA, ABA and JA). The ginsenosides (Rb2, Rc, Re and Rg1) also increased after inoculation of T. citrinoviride. By the real-time PCR quantification of T. citrinoviride, successful endophytism was confirmed. In planta assay, T. citrinoviride inoculation significantly reduced the disease caused by B. cinera and C. destructans in ginseng plants. With this biocontol potential, we developed formulation agents as DP and GR which have been considered to convenience and stability, and those agents were also showed biocontrol activity on B. cinera and C. destructans with ginseng plants. Inoculation of MCG plants with DP and GR by foliar application enhanced disease resistance and gisenoside concentration (Rb1, Rb2, Rc, Re and Rg1) in field tests. These results indicate that T. citrinoviride is a beneficial endophyte with biocontrol properties, and it can increase the quality and yield of MCG plant.
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