포유동물 암컷 생식기관인 난소에서는 미성숙난자(난모세포)가 성숙난자(제2감수분열 중기) 단계까지발달하며, 이 과정동안 1번의 세포질분열(제 1 감수분열)이 일어난다. 성숙 난자는 호르몬 조절(LH surge)에 의해 난관으로 배란된 후, 정자와 만나 수정되고 즉각 두 번째 세포질 분열을 마치게 된다. 이후 난자의 세포질 안에서 각각 난자와 정자 유래의 전핵(pronuclear)이 형성되고, 최초의 ...
포유동물 암컷 생식기관인 난소에서는 미성숙난자(난모세포)가 성숙난자(제2감수분열 중기) 단계까지발달하며, 이 과정동안 1번의 세포질분열(제 1 감수분열)이 일어난다. 성숙 난자는 호르몬 조절(LH surge)에 의해 난관으로 배란된 후, 정자와 만나 수정되고 즉각 두 번째 세포질 분열을 마치게 된다. 이후 난자의 세포질 안에서 각각 난자와 정자 유래의 전핵(pronuclear)이 형성되고, 최초의 체세포분열(mitosis)을 개시하여 2세포기로 배발생이 진행된다. 일반 체세포 분열이 두 개의 세포로 대칭분열 되는 것과는 달리, 난자의 감수분열 과정은 크기가 큰 난자와 작은 두 개의 극체로 비대칭분열이 일어난다. 비대칭 분열이 일어나는 이유는 제1감수분열 과정동안 가운데에서 형성된 방추사(meiotic spindle)가 cortex로 이동하여 분열하며, 제2감수분열 중기의 핵이 세포막(cortex) 부근에 머물러 있다가 수정 후 그 자리에서 세포질 분열이 일어나기 때문이다. 난자 성숙 과정동안 핵과 방추사가 이동할 수 있는 힘의 원천은 난자 세포질내의 액틴 사이토스켈레톤(actin cytoskeleton)의 동적인 변화(dynamics)로부터 나온다. 본 연구에서는, 액틴의 동적인 변화가 어떤 조절기작에 의해 이루어지는지를 밝혀냄으로써 난자의 감수분열동안 일어나는 비대칭분열의 원인을 밝히고자 하였다. 특히, 액틴의 생성, 유지, 보호에 역할 하는 액틴결합단백질(Actin binding proteins; ABPs)의 기능과 그들의 조절 기작을 여러 실험적 기법을 통해 조사하였다. 궁극적으로는, 포유류의 미성숙난자의 감수분열과정에서 일어나는 비대칭분열로부터 수정 이후 초기배아발달과정에서 일어나는 대칭분열로 전환되는 분자적 기전을 액틴구조의 변화에 따라 설명하고자 한다. 액틴(Actin)은 분자량 43KDa의 단백질로써 동물세포 내에서 가장 많은 양을 차지한다. 이는 단량체인 G-액틴이 여러 개 합성(polymerization)되어 F-액틴 형태를 이루며, 이 상태로 세포내에서 여러 가지 역할을 수행한다. 비 근육세포에서 액틴의 역할은 대표적으로 세포의 이동, 세포분열, 세포 회전 등 세포 생명현상의 많은 부분을 차지한다. 그 중에서도, 난자 내에 존재하는 액틴은 그 구조와 모양에 따라 크게 세 가지로 나누어 설명할 수 있다. (1) 난자 세포막(cortex)을 이루고 있는 ‘Cortical actin’ : 난자 성숙과정동안 세포막을 이루고 있는 액틴은 전체적으로 점점 두꺼워 진다고 알려져 있다. 특히, 방추사와 핵이 이동한 주변(animal pole)의 액틴은 더욱 두껍게 형성되는데 이를 ‘Actin cap‘이라고 하며, 세포 극형성(polarization)의 한 요소이다. 주로 Arp2/3 complex라는 액틴 뉴클리에이터(Actin nucleator)에 의해 형성된다. (2) 세포질 내 액틴 메시(Cytoplasmic actin mesh) : 난자의 세포질 내의 액틴의 밀도는 성숙과정동안 점점 증가한다. 세포질 내 액틴 생성은 세포 내 소낭을 중심으로, 주로 Formin / Spire와 같은 액틴뉴클리에이터(Actin nucleator)에 의해 형성된다고 알려져 있다. (3) 스핀들 액틴(Spindle actin; Cage actin mesh) : 방추사를 둘러싸고 있는 모양의 액틴으로, 방추사가 이동함에 따라 함께 움직이며 방추사를 보호하며 핵분열에 영향을 준다. 이러한 액틴필라멘트는 난자의 감수분열 전 과정에서 방추사의 형성 및 이동, 핵분열, 세포질 분열, 비대칭 분열 등 전반적인 현상에 역할 한다. 이러한 액틴의 형성과 분해를 조절은 바로 액틴결합단백질(ABPs)에 의해 일어난다. 액틴결합단백질 종류는 매우 많지만 기능에 따라 크게 세 가지로 분류해 볼 수 있다. Class 1) 새로운 액틴 가닥을 만들어 내는 Actin nucleators, Class 2) 생성된 액틴가닥을 보호하는 액틴캡핑단백질(Actin capping protein), Class 3) 액틴을 분해하는 cofillin등의 분해단백질이 있다. ChapterⅡ에서는 Class 2에 해당하는 액틴보호단백질 중 하나인 Tropomodulin-3(Tmod3)의 쥐 난자의 성숙과정동안 역할에 관한 내용을 서술하였다. 각 성숙 단계별로 mRNA와 단백질 수준에서의 발현을 조사하였고, 면역염색법을 통해 난자 내 위치를 조사하였다. Tropomodulin-3의 기능적 역할을 알아보고자 double-strand RNA(dsRNA)를 세포 내 주입하여 mRNA 발현수준을 저해시킴으로써(Knockdown) 일어나는 표현형을 분석하였다. 또한, 반대로 실험실에서 합성한 Tropomodulin-3-GFP cRNA를 세포내에 주입하여 인위적으로 과발현 환경을 만들어 주어 세포질 내의 액틴 양의 변화, 비대칭 분열에 미치는 영향 등의 표현형을 조사하였다. 또한, 다른 액틴 보호 단백질인 Tropomyosin과 함께 Knockdown하여 세포질 내 액틴 양에 미치는 영향을 살펴보았다. 더 나아가, 세포질 액틴을 생성해내는 단백질인 Formin을 인위적으로 과발현 시킴과 동시에 Tmod3를 Knockdown함으로써 일어나는 상호작용을 알아보았다. ChapterⅢ에서는 Class 1에 해당하는 액틴생성단백질 중 하나인 Spire의 상위 조절인자에 대해 연구하였다. 다른 액틴뉴클리에이터들과는 달리 Spire의 경우 그 조절메커니즘에 관해 아직까지 잘 알려진 바가 없는데, 본 연구에서는 조절 인자로써의 아연의 역할에 대해 조사하였다. 아연 저해물질(chelator)인 ‘TPEN’을 난자에 처리하였을 때, 난자의 비대칭분열과 세포질 내 액틴메시의 양에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, TPEN처리 시, 세포 내 아연이 감소함으로써 Spire의 위치와 활성 저해 현상을 콘포칼 촬영기법과 실시간 세포 관찰(Live cell imaging)을 통해 확인하였다. 한편, Spire의 단백질 구조 중 C-말단에 존재하는 아연결합부위(zinc-binding region)에 돌연변이를 주어 Spire의 세포 내 위치 변화와 액틴형성 역할이 어떻게 변하는지를 조사하였다. 더 나아가, Spire 단백질 구조의 여러 가지 형태의 돌연변이를 세포 내 주입함으로써 도메인(domain) 별 역할 변화에 대해 조사함으로써, 보다 자세한 Spire의 기능적 역할을 밝혀냈다. 마지막으로, 난자가 정자와 수정을 한 직후, 세포질 내에 축적되어 있던 아연이 한꺼번에 세포 외부로 방출되는 ‘Zinc spark’가 일어나는 과정 동안 Spire의 변화에 대해서도 관찰하였다. 이 연구를 통해, 난자성숙과정과 수정이후 기작에서의 Spire 역할과 이를 조절하는 상위 인자로써의 아연의 역할에 대해 최초로 밝혔다. ChapterⅣ에서는 Class 1에 속하며 난자의 세포질을 이루고 있는 액틴을 생성한다고 알려진 Arp2/3 complex의 상위 조절인자에 관한 연구내용을 서술하였다. 액틴뉴클리에이터인 Arp2/3를 촉진하는 뉴클리에이터촉진인자(Nuicleation promoting factors; NPFs) 중 하나인 ‘WHAMM’의 난자성숙과정동안 역할에 관하여 조사하였다. WHAMM의 mRNA 발현정도를 실시간역전사(real-time reverse transcription) PCR을 통해 조사하였다. 또한, 난자 내 위치를 면역염색법으로 조사하였다. dsRNA를 세포질 내에 주입하여 WHAMM을 Knockdown함으로써 방추사의 형성과 유지, Cage actin mesh의 형성 그리고 염색체 정렬 및 분열에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 소포체-골지체 간 소낭 전달을 저해하는 물질인 BrefeldinA(BFA)를 처리하여 WHAMM의 위치 변화를 조사함으로써 세포 내 소기관과 방추사 그리고 액틴을 연결하는 WHAMM의 역할을 규명하였다. 본 논문에서는, 난자의 성숙과정과 수정이후 변화에 있어서 중요한 몇 가지 액틴결합단백질들의 기능 및 조절기작에 대한 연구를 진행함으로써 난자의 비대칭 분열을 조절하는 액틴의 역할을 규명하였다. 본 논문을 통해 난자의 비대칭분열 과정과 수정이후 초기배아발달의 대칭분열의 전환을 한걸음 더 이해할 수 있게 되었다는 점에서 의의가 있다.
포유동물 암컷 생식기관인 난소에서는 미성숙난자(난모세포)가 성숙난자(제2감수분열 중기) 단계까지발달하며, 이 과정동안 1번의 세포질분열(제 1 감수분열)이 일어난다. 성숙 난자는 호르몬 조절(LH surge)에 의해 난관으로 배란된 후, 정자와 만나 수정되고 즉각 두 번째 세포질 분열을 마치게 된다. 이후 난자의 세포질 안에서 각각 난자와 정자 유래의 전핵(pronuclear)이 형성되고, 최초의 체세포분열(mitosis)을 개시하여 2세포기로 배발생이 진행된다. 일반 체세포 분열이 두 개의 세포로 대칭분열 되는 것과는 달리, 난자의 감수분열 과정은 크기가 큰 난자와 작은 두 개의 극체로 비대칭분열이 일어난다. 비대칭 분열이 일어나는 이유는 제1감수분열 과정동안 가운데에서 형성된 방추사(meiotic spindle)가 cortex로 이동하여 분열하며, 제2감수분열 중기의 핵이 세포막(cortex) 부근에 머물러 있다가 수정 후 그 자리에서 세포질 분열이 일어나기 때문이다. 난자 성숙 과정동안 핵과 방추사가 이동할 수 있는 힘의 원천은 난자 세포질내의 액틴 사이토스켈레톤(actin cytoskeleton)의 동적인 변화(dynamics)로부터 나온다. 본 연구에서는, 액틴의 동적인 변화가 어떤 조절기작에 의해 이루어지는지를 밝혀냄으로써 난자의 감수분열동안 일어나는 비대칭분열의 원인을 밝히고자 하였다. 특히, 액틴의 생성, 유지, 보호에 역할 하는 액틴결합단백질(Actin binding proteins; ABPs)의 기능과 그들의 조절 기작을 여러 실험적 기법을 통해 조사하였다. 궁극적으로는, 포유류의 미성숙난자의 감수분열과정에서 일어나는 비대칭분열로부터 수정 이후 초기배아발달과정에서 일어나는 대칭분열로 전환되는 분자적 기전을 액틴구조의 변화에 따라 설명하고자 한다. 액틴(Actin)은 분자량 43KDa의 단백질로써 동물세포 내에서 가장 많은 양을 차지한다. 이는 단량체인 G-액틴이 여러 개 합성(polymerization)되어 F-액틴 형태를 이루며, 이 상태로 세포내에서 여러 가지 역할을 수행한다. 비 근육세포에서 액틴의 역할은 대표적으로 세포의 이동, 세포분열, 세포 회전 등 세포 생명현상의 많은 부분을 차지한다. 그 중에서도, 난자 내에 존재하는 액틴은 그 구조와 모양에 따라 크게 세 가지로 나누어 설명할 수 있다. (1) 난자 세포막(cortex)을 이루고 있는 ‘Cortical actin’ : 난자 성숙과정동안 세포막을 이루고 있는 액틴은 전체적으로 점점 두꺼워 진다고 알려져 있다. 특히, 방추사와 핵이 이동한 주변(animal pole)의 액틴은 더욱 두껍게 형성되는데 이를 ‘Actin cap‘이라고 하며, 세포 극형성(polarization)의 한 요소이다. 주로 Arp2/3 complex라는 액틴 뉴클리에이터(Actin nucleator)에 의해 형성된다. (2) 세포질 내 액틴 메시(Cytoplasmic actin mesh) : 난자의 세포질 내의 액틴의 밀도는 성숙과정동안 점점 증가한다. 세포질 내 액틴 생성은 세포 내 소낭을 중심으로, 주로 Formin / Spire와 같은 액틴뉴클리에이터(Actin nucleator)에 의해 형성된다고 알려져 있다. (3) 스핀들 액틴(Spindle actin; Cage actin mesh) : 방추사를 둘러싸고 있는 모양의 액틴으로, 방추사가 이동함에 따라 함께 움직이며 방추사를 보호하며 핵분열에 영향을 준다. 이러한 액틴필라멘트는 난자의 감수분열 전 과정에서 방추사의 형성 및 이동, 핵분열, 세포질 분열, 비대칭 분열 등 전반적인 현상에 역할 한다. 이러한 액틴의 형성과 분해를 조절은 바로 액틴결합단백질(ABPs)에 의해 일어난다. 액틴결합단백질 종류는 매우 많지만 기능에 따라 크게 세 가지로 분류해 볼 수 있다. Class 1) 새로운 액틴 가닥을 만들어 내는 Actin nucleators, Class 2) 생성된 액틴가닥을 보호하는 액틴캡핑단백질(Actin capping protein), Class 3) 액틴을 분해하는 cofillin등의 분해단백질이 있다. ChapterⅡ에서는 Class 2에 해당하는 액틴보호단백질 중 하나인 Tropomodulin-3(Tmod3)의 쥐 난자의 성숙과정동안 역할에 관한 내용을 서술하였다. 각 성숙 단계별로 mRNA와 단백질 수준에서의 발현을 조사하였고, 면역염색법을 통해 난자 내 위치를 조사하였다. Tropomodulin-3의 기능적 역할을 알아보고자 double-strand RNA(dsRNA)를 세포 내 주입하여 mRNA 발현수준을 저해시킴으로써(Knockdown) 일어나는 표현형을 분석하였다. 또한, 반대로 실험실에서 합성한 Tropomodulin-3-GFP cRNA를 세포내에 주입하여 인위적으로 과발현 환경을 만들어 주어 세포질 내의 액틴 양의 변화, 비대칭 분열에 미치는 영향 등의 표현형을 조사하였다. 또한, 다른 액틴 보호 단백질인 Tropomyosin과 함께 Knockdown하여 세포질 내 액틴 양에 미치는 영향을 살펴보았다. 더 나아가, 세포질 액틴을 생성해내는 단백질인 Formin을 인위적으로 과발현 시킴과 동시에 Tmod3를 Knockdown함으로써 일어나는 상호작용을 알아보았다. ChapterⅢ에서는 Class 1에 해당하는 액틴생성단백질 중 하나인 Spire의 상위 조절인자에 대해 연구하였다. 다른 액틴뉴클리에이터들과는 달리 Spire의 경우 그 조절메커니즘에 관해 아직까지 잘 알려진 바가 없는데, 본 연구에서는 조절 인자로써의 아연의 역할에 대해 조사하였다. 아연 저해물질(chelator)인 ‘TPEN’을 난자에 처리하였을 때, 난자의 비대칭분열과 세포질 내 액틴메시의 양에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, TPEN처리 시, 세포 내 아연이 감소함으로써 Spire의 위치와 활성 저해 현상을 콘포칼 촬영기법과 실시간 세포 관찰(Live cell imaging)을 통해 확인하였다. 한편, Spire의 단백질 구조 중 C-말단에 존재하는 아연결합부위(zinc-binding region)에 돌연변이를 주어 Spire의 세포 내 위치 변화와 액틴형성 역할이 어떻게 변하는지를 조사하였다. 더 나아가, Spire 단백질 구조의 여러 가지 형태의 돌연변이를 세포 내 주입함으로써 도메인(domain) 별 역할 변화에 대해 조사함으로써, 보다 자세한 Spire의 기능적 역할을 밝혀냈다. 마지막으로, 난자가 정자와 수정을 한 직후, 세포질 내에 축적되어 있던 아연이 한꺼번에 세포 외부로 방출되는 ‘Zinc spark’가 일어나는 과정 동안 Spire의 변화에 대해서도 관찰하였다. 이 연구를 통해, 난자성숙과정과 수정이후 기작에서의 Spire 역할과 이를 조절하는 상위 인자로써의 아연의 역할에 대해 최초로 밝혔다. ChapterⅣ에서는 Class 1에 속하며 난자의 세포질을 이루고 있는 액틴을 생성한다고 알려진 Arp2/3 complex의 상위 조절인자에 관한 연구내용을 서술하였다. 액틴뉴클리에이터인 Arp2/3를 촉진하는 뉴클리에이터촉진인자(Nuicleation promoting factors; NPFs) 중 하나인 ‘WHAMM’의 난자성숙과정동안 역할에 관하여 조사하였다. WHAMM의 mRNA 발현정도를 실시간역전사(real-time reverse transcription) PCR을 통해 조사하였다. 또한, 난자 내 위치를 면역염색법으로 조사하였다. dsRNA를 세포질 내에 주입하여 WHAMM을 Knockdown함으로써 방추사의 형성과 유지, Cage actin mesh의 형성 그리고 염색체 정렬 및 분열에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 소포체-골지체 간 소낭 전달을 저해하는 물질인 BrefeldinA(BFA)를 처리하여 WHAMM의 위치 변화를 조사함으로써 세포 내 소기관과 방추사 그리고 액틴을 연결하는 WHAMM의 역할을 규명하였다. 본 논문에서는, 난자의 성숙과정과 수정이후 변화에 있어서 중요한 몇 가지 액틴결합단백질들의 기능 및 조절기작에 대한 연구를 진행함으로써 난자의 비대칭 분열을 조절하는 액틴의 역할을 규명하였다. 본 논문을 통해 난자의 비대칭분열 과정과 수정이후 초기배아발달의 대칭분열의 전환을 한걸음 더 이해할 수 있게 되었다는 점에서 의의가 있다.
Keyword
#mouse oocyte maturation actin Actin binding protein
학위논문 정보
저자
조유진
학위수여기관
충북대학교
학위구분
국내박사
학과
축산·원예·식품공학 축산학전공
지도교수
김남형
발행연도
2018
총페이지
x, 177 p.
키워드
mouse oocyte maturation actin Actin binding protein
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