[학위논문]베큘로바이러스를 이용한 새우흰반점 바이러스 유전자 백신 개발 및 면역 효능 연구 Development of DNA Vaccine against White Spot Syndrome Virus Using Baculoviral System and Immunological Studies in Shrimp원문보기
새우흰반점 바이러스 (WSSV)는 다양한 새우종과 여러 갑각류에서 감염을 일으켜 치명적인 치사율을 일으키고 이로 인해 새우 양식업에 막대한 경제적 피해를 주고 있다. 하지만 아직까지 백신이나 치료제가 없는 실정으로 본 연구에서는 새우흰반점의 구조단백질인 VP28과 VP19 유전자를 베큘로바이러스에 도입하여 유전자를 전달할 수 있는 유전자 백신을 제작하였다. 베큘로바이러스를 이용한 유전자 백신의 면역원성을 높이기 위해, 살모넬라의 편모를 이루는 플라젤린 유전자를 도입하여 VP28 또는 VP19 유전자와 융합 하였다. 이렇게 제작된 베큘로바이러스 기반 WSSV백신은 쥐에서 새우흰반점 바이러스에 대한 높은 항체 역가를 나타내었다. 경구용 유전자 백신으로서의 효능을 평가 하기 위해 WSSV 감염 모델인 징거미새우를 이용하여 효능을 평가하였다. VP28과 VP19 유전자를 동시에 전달하는 2가 유전자 백신의 경우 VP28 또는 VP19 유전자만 도입된 유전자 백신에 비해 10% 이상 높은 생존율을 나타내었다. 더욱이, 플라젤린이 융합된 2가 유전자 백신의 경우 89.5%의 높은 생존율 나타내었다. 이러한 플라젤린에 의한 유전자 백신의 효능을 평가 하기 위해, ...
새우흰반점 바이러스 (WSSV)는 다양한 새우종과 여러 갑각류에서 감염을 일으켜 치명적인 치사율을 일으키고 이로 인해 새우 양식업에 막대한 경제적 피해를 주고 있다. 하지만 아직까지 백신이나 치료제가 없는 실정으로 본 연구에서는 새우흰반점의 구조단백질인 VP28과 VP19 유전자를 베큘로바이러스에 도입하여 유전자를 전달할 수 있는 유전자 백신을 제작하였다. 베큘로바이러스를 이용한 유전자 백신의 면역원성을 높이기 위해, 살모넬라의 편모를 이루는 플라젤린 유전자를 도입하여 VP28 또는 VP19 유전자와 융합 하였다. 이렇게 제작된 베큘로바이러스 기반 WSSV백신은 쥐에서 새우흰반점 바이러스에 대한 높은 항체 역가를 나타내었다. 경구용 유전자 백신으로서의 효능을 평가 하기 위해 WSSV 감염 모델인 징거미새우를 이용하여 효능을 평가하였다. VP28과 VP19 유전자를 동시에 전달하는 2가 유전자 백신의 경우 VP28 또는 VP19 유전자만 도입된 유전자 백신에 비해 10% 이상 높은 생존율을 나타내었다. 더욱이, 플라젤린이 융합된 2가 유전자 백신의 경우 89.5%의 높은 생존율 나타내었다. 이러한 플라젤린에 의한 유전자 백신의 효능을 평가 하기 위해, NF-κB 유전자의 발현을 비교해 보았다. 비교 결과 플라젤린이 도입된 2가 유전자 백신의 경우 다른 그룹의 유전자 백신들보다 높은 발현량을 나타내었습니다. 이러한 결과를 토대로 플라젤린이 도입된 2가 유전자 백신은 앞으로 새우흰반점 바이러스에 대한 예방백신으로 높은 가능성을 나타냈으며, 새로운 경구 유전자 백신으로서의 이용이 가능 할 것으로 예상된다. 더 나아가 무척추동물에서의 면역 시스템으로 새우의 선천성 면역에 대한 조사를 하였다. 새우의 선청성 면역은 톨 수용체에 의한 패턴 인식 시스템에 이해 면역 반응이 유도 된다고 보고 되어 있다. 이러한 선천성 면역 신호전달에 대한 연구를 위해 우리는 징거미새우에서 톨 수용체 존재를 규명하였다. 이렇게 규명된 톨 수용체로 개발한 새우흰반점 바이러스 백신의 효능을 평가 하였다. 평가 결과, 새우흰반점 백신의 경우 톨수용체의 발현량이 음성대조군에 비해 2.5배 이상 발현하는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 새우에서 톨 수용체를 매개로한 선천성 면역이 유도되어 새우흰반점바이러스에 대한 방어기작이 작동 되었을 것으로 예상 할 수 있다. 그러므로 새우에서는 톨 수용체 대한 미생물이나 바이러스에 대한 방어 기작 시스템이 존재 하는 것을 알 수 있으며, 우리의 새우흰반점 백신의 효능을 입증하는 것으로 예상된다.
새우흰반점 바이러스 (WSSV)는 다양한 새우종과 여러 갑각류에서 감염을 일으켜 치명적인 치사율을 일으키고 이로 인해 새우 양식업에 막대한 경제적 피해를 주고 있다. 하지만 아직까지 백신이나 치료제가 없는 실정으로 본 연구에서는 새우흰반점의 구조단백질인 VP28과 VP19 유전자를 베큘로바이러스에 도입하여 유전자를 전달할 수 있는 유전자 백신을 제작하였다. 베큘로바이러스를 이용한 유전자 백신의 면역원성을 높이기 위해, 살모넬라의 편모를 이루는 플라젤린 유전자를 도입하여 VP28 또는 VP19 유전자와 융합 하였다. 이렇게 제작된 베큘로바이러스 기반 WSSV백신은 쥐에서 새우흰반점 바이러스에 대한 높은 항체 역가를 나타내었다. 경구용 유전자 백신으로서의 효능을 평가 하기 위해 WSSV 감염 모델인 징거미새우를 이용하여 효능을 평가하였다. VP28과 VP19 유전자를 동시에 전달하는 2가 유전자 백신의 경우 VP28 또는 VP19 유전자만 도입된 유전자 백신에 비해 10% 이상 높은 생존율을 나타내었다. 더욱이, 플라젤린이 융합된 2가 유전자 백신의 경우 89.5%의 높은 생존율 나타내었다. 이러한 플라젤린에 의한 유전자 백신의 효능을 평가 하기 위해, NF-κB 유전자의 발현을 비교해 보았다. 비교 결과 플라젤린이 도입된 2가 유전자 백신의 경우 다른 그룹의 유전자 백신들보다 높은 발현량을 나타내었습니다. 이러한 결과를 토대로 플라젤린이 도입된 2가 유전자 백신은 앞으로 새우흰반점 바이러스에 대한 예방백신으로 높은 가능성을 나타냈으며, 새로운 경구 유전자 백신으로서의 이용이 가능 할 것으로 예상된다. 더 나아가 무척추동물에서의 면역 시스템으로 새우의 선천성 면역에 대한 조사를 하였다. 새우의 선청성 면역은 톨 수용체에 의한 패턴 인식 시스템에 이해 면역 반응이 유도 된다고 보고 되어 있다. 이러한 선천성 면역 신호전달에 대한 연구를 위해 우리는 징거미새우에서 톨 수용체 존재를 규명하였다. 이렇게 규명된 톨 수용체로 개발한 새우흰반점 바이러스 백신의 효능을 평가 하였다. 평가 결과, 새우흰반점 백신의 경우 톨수용체의 발현량이 음성대조군에 비해 2.5배 이상 발현하는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 새우에서 톨 수용체를 매개로한 선천성 면역이 유도되어 새우흰반점바이러스에 대한 방어기작이 작동 되었을 것으로 예상 할 수 있다. 그러므로 새우에서는 톨 수용체 대한 미생물이나 바이러스에 대한 방어 기작 시스템이 존재 하는 것을 알 수 있으며, 우리의 새우흰반점 백신의 효능을 입증하는 것으로 예상된다.
Despite large economic losses attributable to white spot syndrome virus (WSSV), an infectious pathogen of penaeid shrimp and other crustaceans worldwide, no efficient vaccines or antiviral agents to control the virus are currently available at present. In this study, we designed and constructed bacu...
Despite large economic losses attributable to white spot syndrome virus (WSSV), an infectious pathogen of penaeid shrimp and other crustaceans worldwide, no efficient vaccines or antiviral agents to control the virus are currently available at present. In this study, we designed and constructed baculovirus-based vaccines delivering genes encoding the WSSV envelope proteins, VP28 and VP19. To enhance the immunogenicity of the baculovirus-based vaccine, we fused a Salmonella typhimurium flagellin 2 (FL2) gene with VP28 or VP19 gene. All vaccine constructs elicited similar high titers of anti-WSSV IgG after intramuscular immunization in mice compared negative control groups (non-treatment, Ac-ie1GFP, and AcVP28). The protective effect of oral vaccines upon WSSV challenge was observed in Macrobrachium nipponense. Bivalent vaccine displaying WSSV envelope proteins, VP19 and VP28, enhanced more than 10% survival protection against WSSV infection, compared to monovalent vaccine containing WSSV envelope protein, VP19 or VP28. Furthermore, a baculovirus-based WSSV vaccine fused with FL2 gene, Ac-VP28-ie1VP19FL2, efficiently protected mice against WSSV challenge (89.5% survival rate). To support these results, we verified FL2 enhanced survival rate and confirmed th induction of NF-κB gene in Palaemon paucidens. The collective results strongly suggest that our recombinant baculoviral system displaying WSSV envelope protein and delivering FL2-fused WSSV envelope gene effectively induced protective responses, supporting the utility of a potential new oral DNA vaccine against WSSV. In addition, we further investigated the research progress related to the innate immunity of penaeid shrimp. Several pattern recognition receptors, such as lectin, Toll-like receptor, lipopolysaccharide, b-1,3-glucan binding protein (LGBP) and tetraspanin were identified. The major signal transduction pathways, including Toll pathway, immune deficiency (IMD) pathway, which might be involved in the immune response of shrimp, were focused on and most of the components in Toll pathway were identified. We have identified Toll-like receptors in Macrobrachium nipponense (MnToll), and have shown that they are 90% or more homologous to the Macrobrachium rosenbergii in amino acid sequence comparison. To demonstrate the efficacy of the WSSV DNA vaccine to enhance the immunity of the shrimp, the expression level of the MnToll gene was monitored by qPCR for 12, 24, 48 and 72 hours. As a result, the amount of MnToll gene expression was high from 12 hours to 72 hours. These results suggest that Toll gene is expressed by FL2 gene of WSSV DNA vaccine and innate immunity is increased by Nf-kB gene expression. Therefore, we suggests that there is evidence for innate immunity in shrimp. It also suggests the possibility of our WSSV DNA vaccine as a method to reduce serious infection to WSSV.
Despite large economic losses attributable to white spot syndrome virus (WSSV), an infectious pathogen of penaeid shrimp and other crustaceans worldwide, no efficient vaccines or antiviral agents to control the virus are currently available at present. In this study, we designed and constructed baculovirus-based vaccines delivering genes encoding the WSSV envelope proteins, VP28 and VP19. To enhance the immunogenicity of the baculovirus-based vaccine, we fused a Salmonella typhimurium flagellin 2 (FL2) gene with VP28 or VP19 gene. All vaccine constructs elicited similar high titers of anti-WSSV IgG after intramuscular immunization in mice compared negative control groups (non-treatment, Ac-ie1GFP, and AcVP28). The protective effect of oral vaccines upon WSSV challenge was observed in Macrobrachium nipponense. Bivalent vaccine displaying WSSV envelope proteins, VP19 and VP28, enhanced more than 10% survival protection against WSSV infection, compared to monovalent vaccine containing WSSV envelope protein, VP19 or VP28. Furthermore, a baculovirus-based WSSV vaccine fused with FL2 gene, Ac-VP28-ie1VP19FL2, efficiently protected mice against WSSV challenge (89.5% survival rate). To support these results, we verified FL2 enhanced survival rate and confirmed th induction of NF-κB gene in Palaemon paucidens. The collective results strongly suggest that our recombinant baculoviral system displaying WSSV envelope protein and delivering FL2-fused WSSV envelope gene effectively induced protective responses, supporting the utility of a potential new oral DNA vaccine against WSSV. In addition, we further investigated the research progress related to the innate immunity of penaeid shrimp. Several pattern recognition receptors, such as lectin, Toll-like receptor, lipopolysaccharide, b-1,3-glucan binding protein (LGBP) and tetraspanin were identified. The major signal transduction pathways, including Toll pathway, immune deficiency (IMD) pathway, which might be involved in the immune response of shrimp, were focused on and most of the components in Toll pathway were identified. We have identified Toll-like receptors in Macrobrachium nipponense (MnToll), and have shown that they are 90% or more homologous to the Macrobrachium rosenbergii in amino acid sequence comparison. To demonstrate the efficacy of the WSSV DNA vaccine to enhance the immunity of the shrimp, the expression level of the MnToll gene was monitored by qPCR for 12, 24, 48 and 72 hours. As a result, the amount of MnToll gene expression was high from 12 hours to 72 hours. These results suggest that Toll gene is expressed by FL2 gene of WSSV DNA vaccine and innate immunity is increased by Nf-kB gene expression. Therefore, we suggests that there is evidence for innate immunity in shrimp. It also suggests the possibility of our WSSV DNA vaccine as a method to reduce serious infection to WSSV.
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