Mu-2에 관련된 사멸 유도 유전자(MUDENG, MuD)는 암 치료 개입의 매력적인 표적이 될 수 있지만 정확한 기능(들)은 아직 알려지지 않았다. 최근 발표된 연구는MuD 유전자가 anti-apoptosis 유전자로서의 기능을 가지고 있다고 주장하고 있지만 원래 이 유전자의 명명법에서 추정할 수 있듯이 MuD는 apoptosis 메커니즘에 관여하는 것으로 제안되어 왔다. 따라서 이 유전자의 실제 기능은 아직 밝혀졌다고 할 수 없다. 이 논문을 통해, anti-MuD ScFv(single chain fragment ...
Mu-2에 관련된 사멸 유도 유전자(MUDENG, MuD)는 암 치료 개입의 매력적인 표적이 될 수 있지만 정확한 기능(들)은 아직 알려지지 않았다. 최근 발표된 연구는MuD 유전자가 anti-apoptosis 유전자로서의 기능을 가지고 있다고 주장하고 있지만 원래 이 유전자의 명명법에서 추정할 수 있듯이 MuD는 apoptosis 메커니즘에 관여하는 것으로 제안되어 왔다. 따라서 이 유전자의 실제 기능은 아직 밝혀졌다고 할 수 없다. 이 논문을 통해, anti-MuD ScFv(single chain fragment variable) 및 이를 knockout 시킨 세포를 이용하여 MuD의 기능을 밝히고자 하였다. MuD 유전자는 alpha와 beta 두 가지의 다른 isoform형태로 암호화되어 있는 것으로 여겨져 왔다. alpha형태는 beta형태와 비교했을 때 N 말단에 103개의 여분의 아미노산 잔기를 가지고 있다. 나머지 387개의 아미노산 잔기는 완전히 동일하다. MuD 유전자에 대한 두 개의 상이한 ScFvs (ScFv C22B3/ ScFv M3H9)를 anti-MuD의 단일클론 항체인 C22B3 및 M3H9을 이용하여 제작하였다. ScFv-C22B3 및 ScFv-M3H9는 각각 MuD의 아미노 말단 도메인 및 MuD유전자의 중앙 영역을 인식한다. 즉, ScFv-C22B3은 alpha isoform을 타겟으로 하고 ScFv-M3H9은 alpha 및 beta isoform 모두를 타겟으로 한다. 각각의 ScFv는 U251MG 세포에 ScFvs-pCDNA3를 사용하여 발현시켰다. 내성을 보였고, 이와 반대로 ScFv-M3H9을 발현하는 U251MG 세포를 TRAIL 처리에 높은 민감도를 보였다. 이러한 결과는 alpha 및 beta MuD 유전자를 억제했을 때 U251MG 세포가 TRAIL처리에 매우 민감하게 반응할 것이라는 것을 나타낸다. 이 결과를 증명하기 위해서, CRIPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 두 가지 타입의 MuD knockout 세포를 만들었고 alpha KO 세포는 alpha MuD isoform의 knockout을 위해, beta KO 세포는 alpha 및 beta 형태의 MuD 유전자의 knockout을 연구하기 위해 만들어 졌다. TRAIL에 의해 유도된 세포독성을 확인한 결과 alpha KO세포에서는 독성변화가 없었으나 beta KO 세포에서는 TRAIL 처리에 즉각적인 반응을 보였으며 이는 두 isoform의 knockout이 TRAIL 치료의 세포독성 효과를 증가시킴을 나타낸다. 모두 종합하면, 본 연구에서는 TRAIL이 관여된 신호전달 경로 중에서 MuD 유전자의 anti-apoptosis 기능을 확인하였다. 추가적으로 ScFv-M3H9 항체는 교모세포종 (GBM)에 대한 TRAIL 치료법의 효과를 극대화 시키는데 유용한 도구로 사용될 수 있다.
Mu-2에 관련된 사멸 유도 유전자(MUDENG, MuD)는 암 치료 개입의 매력적인 표적이 될 수 있지만 정확한 기능(들)은 아직 알려지지 않았다. 최근 발표된 연구는MuD 유전자가 anti-apoptosis 유전자로서의 기능을 가지고 있다고 주장하고 있지만 원래 이 유전자의 명명법에서 추정할 수 있듯이 MuD는 apoptosis 메커니즘에 관여하는 것으로 제안되어 왔다. 따라서 이 유전자의 실제 기능은 아직 밝혀졌다고 할 수 없다. 이 논문을 통해, anti-MuD ScFv(single chain fragment variable) 및 이를 knockout 시킨 세포를 이용하여 MuD의 기능을 밝히고자 하였다. MuD 유전자는 alpha와 beta 두 가지의 다른 isoform형태로 암호화되어 있는 것으로 여겨져 왔다. alpha형태는 beta형태와 비교했을 때 N 말단에 103개의 여분의 아미노산 잔기를 가지고 있다. 나머지 387개의 아미노산 잔기는 완전히 동일하다. MuD 유전자에 대한 두 개의 상이한 ScFvs (ScFv C22B3/ ScFv M3H9)를 anti-MuD의 단일클론 항체인 C22B3 및 M3H9을 이용하여 제작하였다. ScFv-C22B3 및 ScFv-M3H9는 각각 MuD의 아미노 말단 도메인 및 MuD유전자의 중앙 영역을 인식한다. 즉, ScFv-C22B3은 alpha isoform을 타겟으로 하고 ScFv-M3H9은 alpha 및 beta isoform 모두를 타겟으로 한다. 각각의 ScFv는 U251MG 세포에 ScFvs-pCDNA3를 사용하여 발현시켰다. 내성을 보였고, 이와 반대로 ScFv-M3H9을 발현하는 U251MG 세포를 TRAIL 처리에 높은 민감도를 보였다. 이러한 결과는 alpha 및 beta MuD 유전자를 억제했을 때 U251MG 세포가 TRAIL처리에 매우 민감하게 반응할 것이라는 것을 나타낸다. 이 결과를 증명하기 위해서, CRIPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 두 가지 타입의 MuD knockout 세포를 만들었고 alpha KO 세포는 alpha MuD isoform의 knockout을 위해, beta KO 세포는 alpha 및 beta 형태의 MuD 유전자의 knockout을 연구하기 위해 만들어 졌다. TRAIL에 의해 유도된 세포독성을 확인한 결과 alpha KO세포에서는 독성변화가 없었으나 beta KO 세포에서는 TRAIL 처리에 즉각적인 반응을 보였으며 이는 두 isoform의 knockout이 TRAIL 치료의 세포독성 효과를 증가시킴을 나타낸다. 모두 종합하면, 본 연구에서는 TRAIL이 관여된 신호전달 경로 중에서 MuD 유전자의 anti-apoptosis 기능을 확인하였다. 추가적으로 ScFv-M3H9 항체는 교모세포종 (GBM)에 대한 TRAIL 치료법의 효과를 극대화 시키는데 유용한 도구로 사용될 수 있다.
Mu-2-related death-inducing gene (MUDENG, MuD), can be an attractive target for cancer therapeutic intervention, however its precise function(s) is yet unknown. It has been first suggested that MuD involved in the death-inducing mechanism being assumed from the nomenclature of this gene, however a r...
Mu-2-related death-inducing gene (MUDENG, MuD), can be an attractive target for cancer therapeutic intervention, however its precise function(s) is yet unknown. It has been first suggested that MuD involved in the death-inducing mechanism being assumed from the nomenclature of this gene, however a recent report claimed that MuD might function as anti-apoptotic gene. Therefore, the real function of this gene has been still remained to be elucidated. In this thesis, the function(s) of MuD has been demonstrated by using anti-MuD scFv (single chain fragment variable) and its knockout cells. The MuD gene has been thought to encode two different isoforms, alpha and beta. The alpha form has 103 extra amino acid residues at the N-terminus compared to the beta isoform. The remaining 387 amino acid residues are completely same each other. Two different scFvs (scFv C22B3/scFv M3H9) against MuD were constructed using anti-MuD monoclonal antibodies C22B3 and M3H9. The ScFv-C22B3 and ScFv-M3H9 recognized amino terminal domain of MuD, and middle region of MuD, respectively. That is, the ScFv-C22B3 target only alpha isoform and ScFv-M3H9 both alpha and beta isoforms. Each scFv was ectopically expressed in U251MG cells by use of scFvs-pCDNA3. The cells expressing anti-MuDScFv-C22B3 showed resistant to TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), on the contrary, scFv-M3H9 neither U251-MG cells made sensitized nor resistant to TRAIL treatment significantly. In order to confirm these results, two kinds of MuD knock out cells using the CRIPR/Cas9 genome editing system were made -: the alpha KO cells that knock out (KO) for the alpha MuD isoform and the beta KO cells that are KO for both the alpha and the beta isoforms of MuD. TRAIL induced cytotoxicity was not altered in the alpha KO, while beta KO were significantly sensitized to TRAIL treatment, indicating that KO of both isoforms enhances the cytotoxic effect of TRAIL treatment. Taken together, this study indicates an anti-apoptotic function of MuD during the TRAIL mediated death signaling.
Mu-2-related death-inducing gene (MUDENG, MuD), can be an attractive target for cancer therapeutic intervention, however its precise function(s) is yet unknown. It has been first suggested that MuD involved in the death-inducing mechanism being assumed from the nomenclature of this gene, however a recent report claimed that MuD might function as anti-apoptotic gene. Therefore, the real function of this gene has been still remained to be elucidated. In this thesis, the function(s) of MuD has been demonstrated by using anti-MuD scFv (single chain fragment variable) and its knockout cells. The MuD gene has been thought to encode two different isoforms, alpha and beta. The alpha form has 103 extra amino acid residues at the N-terminus compared to the beta isoform. The remaining 387 amino acid residues are completely same each other. Two different scFvs (scFv C22B3/scFv M3H9) against MuD were constructed using anti-MuD monoclonal antibodies C22B3 and M3H9. The ScFv-C22B3 and ScFv-M3H9 recognized amino terminal domain of MuD, and middle region of MuD, respectively. That is, the ScFv-C22B3 target only alpha isoform and ScFv-M3H9 both alpha and beta isoforms. Each scFv was ectopically expressed in U251MG cells by use of scFvs-pCDNA3. The cells expressing anti-MuDScFv-C22B3 showed resistant to TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL), on the contrary, scFv-M3H9 neither U251-MG cells made sensitized nor resistant to TRAIL treatment significantly. In order to confirm these results, two kinds of MuD knock out cells using the CRIPR/Cas9 genome editing system were made -: the alpha KO cells that knock out (KO) for the alpha MuD isoform and the beta KO cells that are KO for both the alpha and the beta isoforms of MuD. TRAIL induced cytotoxicity was not altered in the alpha KO, while beta KO were significantly sensitized to TRAIL treatment, indicating that KO of both isoforms enhances the cytotoxic effect of TRAIL treatment. Taken together, this study indicates an anti-apoptotic function of MuD during the TRAIL mediated death signaling.
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