본 연구실에서는 선행연구에서 지방줄기세포에 SV40의 T항원 유전자를 도입하여 immortalization시킨 ADSC-T 세포주를 개발하였다. 본 연구는 이 ADSC-T 세포주의 세포증식속도, 분화능력을 검증하고, ADSC-T 세포를 무혈청, 무항생제 배양하여 생산한 배양액의 항염증 효능을 검증하였으며, 항염증작용의 mechanism을 규명하고자 하였다. Immortalization되어진 ADSC-T 세포주의 특성을 확인하기 위하여 ADSC-T의 세포증식 속도를 측정하였다. Cell counting을 통하여 primary ADSC와의 증식 속도를 비교하였으며 실험결과 ADSC-T의 증식속도가 primary ADSC에 비해 3.5배 증가함을 보였다. 세포수명은 primary ADSC가 약 한 달 정도에서 세포증식을 멈추는 반면 ADSC-T는 약 7개월 가량 일정한 빠른 속도로 증식하였다. ADSC-T 세포주가 ADSC의 phenotype을 유지하고 있는지 확인하기 위하여 지방 또는 골세포로의 분화능력을 확인하였다. 1-methyl-3-isobutylxanthine, ...
본 연구실에서는 선행연구에서 지방줄기세포에 SV40의 T항원 유전자를 도입하여 immortalization시킨 ADSC-T 세포주를 개발하였다. 본 연구는 이 ADSC-T 세포주의 세포증식속도, 분화능력을 검증하고, ADSC-T 세포를 무혈청, 무항생제 배양하여 생산한 배양액의 항염증 효능을 검증하였으며, 항염증작용의 mechanism을 규명하고자 하였다. Immortalization되어진 ADSC-T 세포주의 특성을 확인하기 위하여 ADSC-T의 세포증식 속도를 측정하였다. Cell counting을 통하여 primary ADSC와의 증식 속도를 비교하였으며 실험결과 ADSC-T의 증식속도가 primary ADSC에 비해 3.5배 증가함을 보였다. 세포수명은 primary ADSC가 약 한 달 정도에서 세포증식을 멈추는 반면 ADSC-T는 약 7개월 가량 일정한 빠른 속도로 증식하였다. ADSC-T 세포주가 ADSC의 phenotype을 유지하고 있는지 확인하기 위하여 지방 또는 골세포로의 분화능력을 확인하였다. 1-methyl-3-isobutylxanthine, indomethacin, dexamethasone 그리고 insulin을 이용하여 지방세포로의 분화를 유도하였으며 RT-PCR을 수행하여 지방세포 특이적인 PPARγ-2 및 adipsin의 발현이 크게 증가함을 입증하였다. 또한 Oil Red O staining을 시행한 결과 ADSC-T에 지방액포가 명확히 형성되었음을 확인하였다. ADSC-T에 Ascorbic acid, β-glycerol phosphate 그리고 dexamethasone을 이용하여 골세포로의 분화를 유도하여 RT-PCR을 통해 확인하였다. 골세포 특이적인 RUNX-2 및 osteopontin의 발현이 크게 증가함을 입증하였다. 또한 조직학적 검사로 Von Kossa staining을 통해 세포막에 형성된 무기질이 검게 염색되었음을 볼 수 있었다. 이로서 ADSC-T 세포주는 분화능력을 보유하고 있음을 확인하였다. 한편, 줄기세포를 배양할 경우 배양액에는 무수히 많은 성장인자들이 함유되어 있는데 이는 미백, 발모 또는 상처치유 효능을 가지는 것으로 확인되었다. 현재 식약처에 고시된 바에 따르면 줄기세포를 의약품으로 사용할 경우 혈청이 포함되지 않은 제품을 허가한다고 명시되어있다. 따라서 본 논문에서는 ADSC-T를 이용한 무혈청 줄기세포 배양액을 생산하였으며 이를 통해 항염증 효능을 검증하였다. 결과적으로 ADSC-T 배양액으로 인한 COX-2, iNOS, STAT3, Akt, MAPKs에 대한 억제를 western blotting 분석을 통해 확인함으로서 ADSC-T 배양액의 항염증 효능을 검증하였다. ADSC-T 배양액의 항염증 효능을 입증하기 위한 추가 실험으로서 pro-inflammatory cytokines 발현을 알아보고자 RT-PCR을 수행하였다. 대표적인 pro-inflammatory cytokine으로 IL-1β, IL-6, iNOS의 발현을 확인하기 위하여 RT-PCR로 분석한 결과, IL-1β는 미세하게 줄어들었으며 IL-6는 명백히 줄었음을 확인했다. iNOS의 발현 역시 감소함을 보았고 이러한 결과를 통해 ADSC-T 배양액이 pro- inflammatory cytokines의 과도한 발현을 억제하는 것으로 확인하였다. 이로서 ADSC-T 배양액이 염증과 관련한 여러 신호전달 인자들의 발현을 억제시킴을 통해 항염증 효능이 있다는 사실을 검증하였으며 나아가 줄기세포 배양액 치료제로의 상용화와 유효성을 명백히 확인하였다. 따라서 본 실험에서는 결론적으로 ADSC-T 세포주가 향후 난치성 질환을 앓고 있는 환자들을 근본적으로 치료할 수 있는‘줄기세포 치료제’로서의 가능성을 내포하고 있음을 제시한다.
본 연구실에서는 선행연구에서 지방줄기세포에 SV40의 T항원 유전자를 도입하여 immortalization시킨 ADSC-T 세포주를 개발하였다. 본 연구는 이 ADSC-T 세포주의 세포증식속도, 분화능력을 검증하고, ADSC-T 세포를 무혈청, 무항생제 배양하여 생산한 배양액의 항염증 효능을 검증하였으며, 항염증작용의 mechanism을 규명하고자 하였다. Immortalization되어진 ADSC-T 세포주의 특성을 확인하기 위하여 ADSC-T의 세포증식 속도를 측정하였다. Cell counting을 통하여 primary ADSC와의 증식 속도를 비교하였으며 실험결과 ADSC-T의 증식속도가 primary ADSC에 비해 3.5배 증가함을 보였다. 세포수명은 primary ADSC가 약 한 달 정도에서 세포증식을 멈추는 반면 ADSC-T는 약 7개월 가량 일정한 빠른 속도로 증식하였다. ADSC-T 세포주가 ADSC의 phenotype을 유지하고 있는지 확인하기 위하여 지방 또는 골세포로의 분화능력을 확인하였다. 1-methyl-3-isobutylxanthine, indomethacin, dexamethasone 그리고 insulin을 이용하여 지방세포로의 분화를 유도하였으며 RT-PCR을 수행하여 지방세포 특이적인 PPARγ-2 및 adipsin의 발현이 크게 증가함을 입증하였다. 또한 Oil Red O staining을 시행한 결과 ADSC-T에 지방액포가 명확히 형성되었음을 확인하였다. ADSC-T에 Ascorbic acid, β-glycerol phosphate 그리고 dexamethasone을 이용하여 골세포로의 분화를 유도하여 RT-PCR을 통해 확인하였다. 골세포 특이적인 RUNX-2 및 osteopontin의 발현이 크게 증가함을 입증하였다. 또한 조직학적 검사로 Von Kossa staining을 통해 세포막에 형성된 무기질이 검게 염색되었음을 볼 수 있었다. 이로서 ADSC-T 세포주는 분화능력을 보유하고 있음을 확인하였다. 한편, 줄기세포를 배양할 경우 배양액에는 무수히 많은 성장인자들이 함유되어 있는데 이는 미백, 발모 또는 상처치유 효능을 가지는 것으로 확인되었다. 현재 식약처에 고시된 바에 따르면 줄기세포를 의약품으로 사용할 경우 혈청이 포함되지 않은 제품을 허가한다고 명시되어있다. 따라서 본 논문에서는 ADSC-T를 이용한 무혈청 줄기세포 배양액을 생산하였으며 이를 통해 항염증 효능을 검증하였다. 결과적으로 ADSC-T 배양액으로 인한 COX-2, iNOS, STAT3, Akt, MAPKs에 대한 억제를 western blotting 분석을 통해 확인함으로서 ADSC-T 배양액의 항염증 효능을 검증하였다. ADSC-T 배양액의 항염증 효능을 입증하기 위한 추가 실험으로서 pro-inflammatory cytokines 발현을 알아보고자 RT-PCR을 수행하였다. 대표적인 pro-inflammatory cytokine으로 IL-1β, IL-6, iNOS의 발현을 확인하기 위하여 RT-PCR로 분석한 결과, IL-1β는 미세하게 줄어들었으며 IL-6는 명백히 줄었음을 확인했다. iNOS의 발현 역시 감소함을 보았고 이러한 결과를 통해 ADSC-T 배양액이 pro- inflammatory cytokines의 과도한 발현을 억제하는 것으로 확인하였다. 이로서 ADSC-T 배양액이 염증과 관련한 여러 신호전달 인자들의 발현을 억제시킴을 통해 항염증 효능이 있다는 사실을 검증하였으며 나아가 줄기세포 배양액 치료제로의 상용화와 유효성을 명백히 확인하였다. 따라서 본 실험에서는 결론적으로 ADSC-T 세포주가 향후 난치성 질환을 앓고 있는 환자들을 근본적으로 치료할 수 있는‘줄기세포 치료제’로서의 가능성을 내포하고 있음을 제시한다.
Adipose-derived stem cells(ADSCs) are capable of differentiation into multiple lineage of cells and can be used for clinical therapy. However, the ADSCs have poor growth capacity and short life span in cultur, which is an impediment in the production of culture medium. In the previous study, an immo...
Adipose-derived stem cells(ADSCs) are capable of differentiation into multiple lineage of cells and can be used for clinical therapy. However, the ADSCs have poor growth capacity and short life span in cultur, which is an impediment in the production of culture medium. In the previous study, an immortalized ADSCs line (ADSC-T) established by expressing SV40 T antigen. SV40 T antigen is known to have the ability to immortalize and transform a variety of primary animal cells. In this study, Characteristics of ADSC-T investigated. The anti-inflammatory effects of CM of ADSCs-T was examined in lipopolysaccharide(LPS) -stimulated RAW 264.7 macrophages. The results were as follow:
1. ADSC-T cell line showed elevated life span and growth rate. 2. ADSC-T cell line maintained the capacity of differentiation into adipocyte and osteocyte. 3. CM of ADSC-T suppressed the expressions of COX-2, iNOS and IkBα in LPS-treated RAW264.7 macrophage. 4. The levels of p-STAT3, p-AKT and MAPKs(ERK,JNK,p38) decreased by CM of ADSC-T in LPS-treated RAW264.7 macrophage. 5. The mRNA levels of IL-1β, IL-6 and iNOS were suppressed by CM of ADSC-T.
Adipose-derived stem cells(ADSCs) are capable of differentiation into multiple lineage of cells and can be used for clinical therapy. However, the ADSCs have poor growth capacity and short life span in cultur, which is an impediment in the production of culture medium. In the previous study, an immortalized ADSCs line (ADSC-T) established by expressing SV40 T antigen. SV40 T antigen is known to have the ability to immortalize and transform a variety of primary animal cells. In this study, Characteristics of ADSC-T investigated. The anti-inflammatory effects of CM of ADSCs-T was examined in lipopolysaccharide(LPS) -stimulated RAW 264.7 macrophages. The results were as follow:
1. ADSC-T cell line showed elevated life span and growth rate. 2. ADSC-T cell line maintained the capacity of differentiation into adipocyte and osteocyte. 3. CM of ADSC-T suppressed the expressions of COX-2, iNOS and IkBα in LPS-treated RAW264.7 macrophage. 4. The levels of p-STAT3, p-AKT and MAPKs(ERK,JNK,p38) decreased by CM of ADSC-T in LPS-treated RAW264.7 macrophage. 5. The mRNA levels of IL-1β, IL-6 and iNOS were suppressed by CM of ADSC-T.
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.