헴철 생산 환경에서 Corynebacterium glutamicum의 세포 내 철 - 산소 - 에너지 상관관계 연구 Relationships of Intracellular Iron ? Oxygen ? Energy in Corynebacterium glutamicum under Heme Production Condition원문보기
Heme은 생체 내에서 시토크롬(Cytochromes), 글로빈(Globins), 과산화효소(Peroxidases)과 같은 여러 가지 단백질에 필요한 보결분자단이다. Heme의 철 분자는 생체 내에서 Fenton 반응을 통해 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)을 형성해 host의 생장에 영향을 미칠 수 있는데, 선행 연구에서는 GRAS host이고 여러 산물 생산에 이용되고 있는 Corynebacterium glutamicum를 이용해 Heme의 과 발현을 유도한 균주에서 생장저해 및 ...
Heme은 생체 내에서 시토크롬(Cytochromes), 글로빈(Globins), 과산화효소(Peroxidases)과 같은 여러 가지 단백질에 필요한 보결분자단이다. Heme의 철 분자는 생체 내에서 Fenton 반응을 통해 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)을 형성해 host의 생장에 영향을 미칠 수 있는데, 선행 연구에서는 GRAS host이고 여러 산물 생산에 이용되고 있는 Corynebacterium glutamicum를 이용해 Heme의 과 발현을 유도한 균주에서 생장저해 및 ROS 과 발생이 관찰되었고, 또한 Escherichia coli 에서 인공적으로 세포 내 ATP 수준을 증가시켰을 때 ROS가 과 발생하고, 생장이 저해되는 것이 관찰된 바 있다. 따라서 Heme과, ROS를 발생시키는 철 분자, 그리고 생장에 영향이 있는 세포내 에너지인 ATP, 세가지 요인의 관점에서 상관관계를 알아보기 위해 Corynebacterium glutamicum 균주에서 여러 유전자를 결손 시켜 생리변화를 관찰하였다. 첫째로 헴철 관련 2가지 유전자를 결손시켰다. 먼저 hrrSA는 헴철 생합성을 저해하고 헴을 포함하는 단백질, 특히 전자전달계 단백질의 합성을 촉진한다. 또한 헴 산화효소의 전사를 촉진하여 세포 내 헴철 항상성에 관여하는 조절 유전자이다. hrrSA 결손 시 최종 균체량이 야생형의 32 % 로 증가하였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형대비 78 %, ROS가 88 % 감소하였다. 정체기에서는 ATP와 ROS 모두 야생형과 같은 수준을 나타내었다. 철 흡수량은 37 % 로 감소하였다. 두 번째로 hmuO는 hrrSA의 조절을 받아 헴철을 분해하는 유전자이다. hmuO 결손 시 최종균체량, 지수생장기와 정체기에서의 ATP와 ROS, 철 흡수량 모두 야생형과 같은 수준을 나타내었다. 두 번째로 철 관련 조절 유전자를 결손시켜 변화를 관찰 하였다. 첫 번째로 dtxR은 세포 내 철 농도를 조절하는 global regulator이다. dtxR 결손 시 최종균체량은 공급한 철이 적을 때 야생형의 61 % 수준으로 감소하였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형의 61 %, ROS는 68 % 수준으로 감소하였고 정체기에서는 ATP가 야생형 대비 60 %, ROS가 84 % 수준으로 감소하였다. 철 흡수량은 50 % 수준으로 감소하였다. 그 다음으로 ripA는 철을 포함하는 단백질 합성을 저해하는 조절자로, 특히 TCA cycle의 첫 효소인 aconitase 발현을 저해하며, dtxR에 의해 저해되는 조절 유전자이다. ripA 결손 시 최종 균체량이 공급한 철이 적을 때 야생형의 84 % 수준으로 감소하였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형의 89 %, ROS는 34 % 증가하였고, 정체기에서 ATP가 야생형 대비 89%, ROS는 34% 증가하였다. 철 흡수량은 야생형과 같은 수준을 보였다. 이를 통해 ATP와 ROS보다 전자전달계와 TCA cycle의 활성 수준에 따라 생장이 영향을 받는다는 것을 알 수 있었다. 또한 결손균주들에서 헴 철의 과 발현을 유도하였을 때 세포에 미치는 영향에 대해 알아보았다. 첫 번째로, hrrSA 결손균주는 최종 균체량이 79 % 수준으로 감소하였는데, 이는 헴철 과 발현을 하지 않은 때에 비해 회복된 수치이다. 지수생장기에서 ATP는 38 %, ROS는 13 % 증가하지만, 정체기에서 ATP, ROS 모두 84 % 수준으로 감소하였다. 철 흡수량은 84 % 수준으로 감소하였다. 두 번째로, hmuO 결손균주에서는 최종 균체량이 야생형보다 37 % 증가하였다. 지수생장기에서 ATP는 16 %가 증가하였고, ROS는 야생형과 같은 수준을 보였다. 정체기에서는 ATP가 야생형대비 58 %, ROS가 8 % 증가하였다. 철 흡수량은 야생형과 같은 수준을 나타내었다. 세 번째로 dtxR 결손균주는 최종 균체량이 야생형의 71 % 수준으로 감소하였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형과 같은 수준을 보였고, ROS는 62 % 수준으로 감소하였다. 정체기에서 ATP는 야생형의 35 % 수준으로 감소하였고, ROS는 14 % 증가하였다. 철 흡수량은 야생형의 75 % 수준으로 감소하였다. 마지막으로 ripA 결손균주는 최종 균체량이 야생형에 비해 35 % 증가하였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형의 31 %, ROS는 8 % 증가하였다. 정체기에서는 ATP가 야생형의 57 %, ROS가 11% 증가하였다. 철 흡수량은 야생형 대비 34 % 증가하였다. 이를 통해 세포의 생장이 전자전달계와 TCA cycle에 의해 주로 영향을 받는다는 것을 알 수 있었고 이에 의해 ATP와 ROS가 영향을 받는다는 것을 관찰하였다. 또한 헴철의 발현이 세포의 생장에 영향을 줄 수 있다는 것을 관찰하였다. 선행 연구에서, 생산성 증진을 위해 생장속도가 증진된 C.glutamicum인 JH41 진화균주가 adaptive evolution을 통해 구축되었다. JH41 진화균주는 RNA seq 결과 에너지대사 및 전자전달계 유전자들의 발현이 증가하였는데, 이번 연구에서는 헴철 생산 배지에서의 이 균주들의 생리변화 및 헴철 생산을 유도할 시 생리변화에 대해 관찰하였다. 헴철 생산 배지에서 진화균주의 최종 균체량은 야생형대비 80 % 수준을 나타내었다. 지수생장기에서 ATP는 야생형 보다 22 % 증가하였고, ROS는 같은 수준을 보였다. 정체기에서 ATP는 야생형 대비 18 % 증가하였고, ROS는 36 % 증가한 것이 관찰되었다. 철 흡수량은 야생형 대비 46 % 수준을 나타내었다. JH41 진화균주에서 헴철 과 발현을 유도하였을 때, 최종 균체량은 야생형와 같은 수준을 보였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형대비 35 % 증가하였고, ROS는 야생형과 같은 수준을 보였다. 정체기에서는 ATP와 ROS 모두 야생형과 같은 수준이 관찰되었다. 철 흡수는 야생형 대비 28 %의 증가를 보였다. 앞의 실험을 통해 헴철의 발현에 따라 세포의 생리가 변화하는 것을 관찰하였다. 헴철 생산이 세포에 미치는 영향을 조금 더 세밀히 관찰하기 위해 헴철 생산 유도 유전자인 hemA 의 발현 copy수를 조절하여 발현하였다. 이를 위해 플라스미드 상에서 발현하는 것이 아닌 chromosome 상에 integration 시켜 그 생산량과 생리변화를 관찰하였다. 이 결과 균주의 최종 균체량이 야생형보다 30 % (1,2 copy) 증가하였지만, 플라스미드를 통한 발현은 야생형의 80 % 수준으로 감소하였다. 지수생장기에서 세 균주 모두 ATP가 모두 야생형과 같은 수준을 보였지만 ROS는 야생형과 같은 수준을 보인 1,2 copy와 달리 플라스미드 발현 균주에서 21% 증가하였다. 정체기에서는 각각 ATP가 34 %, 61 %, 82 % 증가하였고, ROS는 1 copy가 야생형 대비 93 %, 2 copy가 76 % 수준을 보였고, 플라스미드 발현 시 32 % 증가하였다. 철 흡수는 각각 야생형 대비 46 %, 70 %, 112 % 증가를 보였다. 이 실험을 통해 철과 헴철의 농도가 높아지면 세포 내 ATP를 증가시키지만, ROS의 발생을 유도할 수 있다는 것을 관찰하였다. 발생한 ATP는 세포의 생장에 긍정적인 영향을 미치지만, ROS는 생장에 부정적인 영향을 미치는 것을 관찰하였다. 적은 양의 헴철은 세포의 생장에 도움을 주는데, 이는 ROS의 소거능 때문이라고 추정된다. 이를 통해 세포배양 시 철과 헴철의 농도를 조절하거나, two-stage fermentation을 통해 산물의 생산성을 더욱 높일 수 있을 것으로 추정된다.
Heme은 생체 내에서 시토크롬(Cytochromes), 글로빈(Globins), 과산화효소(Peroxidases)과 같은 여러 가지 단백질에 필요한 보결분자단이다. Heme의 철 분자는 생체 내에서 Fenton 반응을 통해 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)을 형성해 host의 생장에 영향을 미칠 수 있는데, 선행 연구에서는 GRAS host이고 여러 산물 생산에 이용되고 있는 Corynebacterium glutamicum를 이용해 Heme의 과 발현을 유도한 균주에서 생장저해 및 ROS 과 발생이 관찰되었고, 또한 Escherichia coli 에서 인공적으로 세포 내 ATP 수준을 증가시켰을 때 ROS가 과 발생하고, 생장이 저해되는 것이 관찰된 바 있다. 따라서 Heme과, ROS를 발생시키는 철 분자, 그리고 생장에 영향이 있는 세포내 에너지인 ATP, 세가지 요인의 관점에서 상관관계를 알아보기 위해 Corynebacterium glutamicum 균주에서 여러 유전자를 결손 시켜 생리변화를 관찰하였다. 첫째로 헴철 관련 2가지 유전자를 결손시켰다. 먼저 hrrSA는 헴철 생합성을 저해하고 헴을 포함하는 단백질, 특히 전자전달계 단백질의 합성을 촉진한다. 또한 헴 산화효소의 전사를 촉진하여 세포 내 헴철 항상성에 관여하는 조절 유전자이다. hrrSA 결손 시 최종 균체량이 야생형의 32 % 로 증가하였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형대비 78 %, ROS가 88 % 감소하였다. 정체기에서는 ATP와 ROS 모두 야생형과 같은 수준을 나타내었다. 철 흡수량은 37 % 로 감소하였다. 두 번째로 hmuO는 hrrSA의 조절을 받아 헴철을 분해하는 유전자이다. hmuO 결손 시 최종균체량, 지수생장기와 정체기에서의 ATP와 ROS, 철 흡수량 모두 야생형과 같은 수준을 나타내었다. 두 번째로 철 관련 조절 유전자를 결손시켜 변화를 관찰 하였다. 첫 번째로 dtxR은 세포 내 철 농도를 조절하는 global regulator이다. dtxR 결손 시 최종균체량은 공급한 철이 적을 때 야생형의 61 % 수준으로 감소하였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형의 61 %, ROS는 68 % 수준으로 감소하였고 정체기에서는 ATP가 야생형 대비 60 %, ROS가 84 % 수준으로 감소하였다. 철 흡수량은 50 % 수준으로 감소하였다. 그 다음으로 ripA는 철을 포함하는 단백질 합성을 저해하는 조절자로, 특히 TCA cycle의 첫 효소인 aconitase 발현을 저해하며, dtxR에 의해 저해되는 조절 유전자이다. ripA 결손 시 최종 균체량이 공급한 철이 적을 때 야생형의 84 % 수준으로 감소하였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형의 89 %, ROS는 34 % 증가하였고, 정체기에서 ATP가 야생형 대비 89%, ROS는 34% 증가하였다. 철 흡수량은 야생형과 같은 수준을 보였다. 이를 통해 ATP와 ROS보다 전자전달계와 TCA cycle의 활성 수준에 따라 생장이 영향을 받는다는 것을 알 수 있었다. 또한 결손균주들에서 헴 철의 과 발현을 유도하였을 때 세포에 미치는 영향에 대해 알아보았다. 첫 번째로, hrrSA 결손균주는 최종 균체량이 79 % 수준으로 감소하였는데, 이는 헴철 과 발현을 하지 않은 때에 비해 회복된 수치이다. 지수생장기에서 ATP는 38 %, ROS는 13 % 증가하지만, 정체기에서 ATP, ROS 모두 84 % 수준으로 감소하였다. 철 흡수량은 84 % 수준으로 감소하였다. 두 번째로, hmuO 결손균주에서는 최종 균체량이 야생형보다 37 % 증가하였다. 지수생장기에서 ATP는 16 %가 증가하였고, ROS는 야생형과 같은 수준을 보였다. 정체기에서는 ATP가 야생형대비 58 %, ROS가 8 % 증가하였다. 철 흡수량은 야생형과 같은 수준을 나타내었다. 세 번째로 dtxR 결손균주는 최종 균체량이 야생형의 71 % 수준으로 감소하였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형과 같은 수준을 보였고, ROS는 62 % 수준으로 감소하였다. 정체기에서 ATP는 야생형의 35 % 수준으로 감소하였고, ROS는 14 % 증가하였다. 철 흡수량은 야생형의 75 % 수준으로 감소하였다. 마지막으로 ripA 결손균주는 최종 균체량이 야생형에 비해 35 % 증가하였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형의 31 %, ROS는 8 % 증가하였다. 정체기에서는 ATP가 야생형의 57 %, ROS가 11% 증가하였다. 철 흡수량은 야생형 대비 34 % 증가하였다. 이를 통해 세포의 생장이 전자전달계와 TCA cycle에 의해 주로 영향을 받는다는 것을 알 수 있었고 이에 의해 ATP와 ROS가 영향을 받는다는 것을 관찰하였다. 또한 헴철의 발현이 세포의 생장에 영향을 줄 수 있다는 것을 관찰하였다. 선행 연구에서, 생산성 증진을 위해 생장속도가 증진된 C.glutamicum인 JH41 진화균주가 adaptive evolution을 통해 구축되었다. JH41 진화균주는 RNA seq 결과 에너지대사 및 전자전달계 유전자들의 발현이 증가하였는데, 이번 연구에서는 헴철 생산 배지에서의 이 균주들의 생리변화 및 헴철 생산을 유도할 시 생리변화에 대해 관찰하였다. 헴철 생산 배지에서 진화균주의 최종 균체량은 야생형대비 80 % 수준을 나타내었다. 지수생장기에서 ATP는 야생형 보다 22 % 증가하였고, ROS는 같은 수준을 보였다. 정체기에서 ATP는 야생형 대비 18 % 증가하였고, ROS는 36 % 증가한 것이 관찰되었다. 철 흡수량은 야생형 대비 46 % 수준을 나타내었다. JH41 진화균주에서 헴철 과 발현을 유도하였을 때, 최종 균체량은 야생형와 같은 수준을 보였다. 지수생장기에서 ATP는 야생형대비 35 % 증가하였고, ROS는 야생형과 같은 수준을 보였다. 정체기에서는 ATP와 ROS 모두 야생형과 같은 수준이 관찰되었다. 철 흡수는 야생형 대비 28 %의 증가를 보였다. 앞의 실험을 통해 헴철의 발현에 따라 세포의 생리가 변화하는 것을 관찰하였다. 헴철 생산이 세포에 미치는 영향을 조금 더 세밀히 관찰하기 위해 헴철 생산 유도 유전자인 hemA 의 발현 copy수를 조절하여 발현하였다. 이를 위해 플라스미드 상에서 발현하는 것이 아닌 chromosome 상에 integration 시켜 그 생산량과 생리변화를 관찰하였다. 이 결과 균주의 최종 균체량이 야생형보다 30 % (1,2 copy) 증가하였지만, 플라스미드를 통한 발현은 야생형의 80 % 수준으로 감소하였다. 지수생장기에서 세 균주 모두 ATP가 모두 야생형과 같은 수준을 보였지만 ROS는 야생형과 같은 수준을 보인 1,2 copy와 달리 플라스미드 발현 균주에서 21% 증가하였다. 정체기에서는 각각 ATP가 34 %, 61 %, 82 % 증가하였고, ROS는 1 copy가 야생형 대비 93 %, 2 copy가 76 % 수준을 보였고, 플라스미드 발현 시 32 % 증가하였다. 철 흡수는 각각 야생형 대비 46 %, 70 %, 112 % 증가를 보였다. 이 실험을 통해 철과 헴철의 농도가 높아지면 세포 내 ATP를 증가시키지만, ROS의 발생을 유도할 수 있다는 것을 관찰하였다. 발생한 ATP는 세포의 생장에 긍정적인 영향을 미치지만, ROS는 생장에 부정적인 영향을 미치는 것을 관찰하였다. 적은 양의 헴철은 세포의 생장에 도움을 주는데, 이는 ROS의 소거능 때문이라고 추정된다. 이를 통해 세포배양 시 철과 헴철의 농도를 조절하거나, two-stage fermentation을 통해 산물의 생산성을 더욱 높일 수 있을 것으로 추정된다.
주제어
#Heme iron energy oxygen Corynebacterium glutamicum
학위논문 정보
저자
양형모
학위수여기관
가톨릭대학교 일반대학원
학위구분
국내석사
학과
생명공학과 생명공학전공
지도교수
김 필
발행연도
2018
키워드
Heme iron energy oxygen Corynebacterium glutamicum
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