집먼지 진드기 추출물과 TLR4에 결합하는 새로운 집먼지 진드기 알러젠에 의한 알러지 병인기전 연구 Study on Pathogenesis of Allergy Induced by House Dust Mite and a Novel Allergen Binding to TLR4원문보기
Lee, Na Rae
(Graduate School, Eulji University
임상병리학과 임상병리학
국내박사)
집먼지 집드기는 알러지 비염, 천식, 아토피 피부염과 같은 질환을 유발하는 주요 알러젠이다. 알러지의 병인기전은 면역세포들의 사이토카인 분비와 호중구 세포고사 조절이상과 밀접한 연관이 있다. S100A8과 S100A9 단백질들 또한 염증성 질환을 유발하는 주요 단백질들이다. 위의 단백질들은 호중구와 ...
집먼지 집드기는 알러지 비염, 천식, 아토피 피부염과 같은 질환을 유발하는 주요 알러젠이다. 알러지의 병인기전은 면역세포들의 사이토카인 분비와 호중구 세포고사 조절이상과 밀접한 연관이 있다. S100A8과 S100A9 단백질들 또한 염증성 질환을 유발하는 주요 단백질들이다. 위의 단백질들은 호중구와 단구의 세포질에 많이 존재하는 세포질 단백질이다. 이번 연구를 통해 집먼지 진드기가 면역세포들간의 어떤 상호작용을 하여 알러지를 유발시키는지 살펴보고, 더 나아가 TLR4에 결합하는 새로운 집먼지 진드기 단백질이 호중구 세포고사에 끼치는 영향을 알아보고자 했다. 파트 1에서는, 집먼지 진드기에 의해 림프구가 호중구 세포고사를 지연시키는 사이토카인을 방출하는지 여부와 그로 인해 호중구의 세포고사가 조절되는지 확인해 보았다. 호중구의 세포고사가 호중구와 림프구를 같이 배양만 시키면 약하게라도 지연되는 것을 확인하였다. 집먼지 진드기 추출물은 호중구에 단독으로 작용하는 것 보다, 림프구와 호중구의 공동배양에서 호중구 세포고사를 더 억제시켰다. 그 효과는 알러지 환자의 경우 더욱 크게 작용함을 보았다. 집먼지 진드기는 정상인과 알러지 환자의 림프구에서 호중구 세포고사를 지연시키는 사이토카인으로 알려진 IL-6, IL-8, MCP-1, GM-CSF의 분비를 증가시켰다. 집먼지 진드기에 의해 증가된 사이토카인은 protease activated receptor(PAR2)의 억제제인 PAR2i, PI3K의 억제제인 LY294002, AKT 억제제인 AKTi, ERK억제제인 PD98059, NF-кB 억제제인 BAY-11-7085에 의해서 감소하였다. 집먼지 진드기는에 의해 활성된 ERK는 PAR2i와 LY294002에 의해서 억제되었고, NF-кB활성은 PAR2i, LY294002, AKTi, PD98059에 의해 억제되었다. 정상인과 알러지 환자의 림프구에 집먼지 진드기를 처리하여 얻어진 사이토카인들은 caspase 9과 caspase 3 활성을 억제시킴으로 호중구의 세포고사를 지연시켰다. 이전 연구에서 집먼지 진드기에 의해 호중구와 단구의 세포질에 존재하는 단백질인 S100A8과 S100A9의 분비가 증가됨을 확인하였다. 파트 2에서는, S100A8과 S100A9 단백질이 정상인과 알러지 환자의 단구에 주는 활성이 호중구의 세포고사 조절에 끼치는 영향을 알아보았다. S100A8과 S100A9 단백질로 자극한 사람 단구 세포주(THP-1)의 상층액이 caspase 9 와 caspase 3 활성 억제시켜 호중구 세포고사를 지연시켰다. S100A8과S100A9 단백질은 사람 단구 세포주에서 호중구 세포고사 지연인자인MCP-1, IL-6, IL-8의 분비를 증가시켰다. S100A8과 S100A9 단백질에 의해 증가된 사이토카인은 toll-like receptor4의 억제제인 CLI-095, Src의 억제제인 PP2, PKCδ 억제제인 rottlerin, MAP kinase 억제제인 PD98059, SB202190, SP600125, NF-кB 억제제인 BAY-11-7085에 의해서 감소하였다. S100A8과 S100A9 단백질에 의해 활성화된 Src와 PKCδ는 CLI-095에 의해 억제되었고, ERK1/2, p38 MAPK, JNK의 활성은 CLI-095, PP2, rottlerin에 의해 억제되었다. S100A8과 S100A9 단백질은 NF-кB를 활성화 시키고, 이는 CLI-095, PP2, rottlerin, PD98059, SB202190, SP600125에 의해 억제되었다. 앞선 사람 단구 세포주의 실험 결과처럼, S100A8과 S100A9 단백질은 정상인과 알러지 환자의 단구에서 MCP-1, IL-6, IL-8의 분비를 증가시켰다. 증가된 사이토카인 분비는 TLR4, Src, PKCδ, ERK1/2, p38 MAPK, JNK, NF-кB의 신호전달체계를 통해 이루어졌다. 즉, S100A8과 S100A9단백질은 단구를 활성화시켜 사이토카인들의 분비를 증가시키고, 이로 인해 호중구 세포고사가 지연되었다. 파트 3에서, 집먼지 진드기의 단백질 성분들 중에서도TLR4에 결합하는 새로운 알러젠 단백질(Der p X)이 호중구의 세포고사 지연에 영향을 주는지 살펴보았다. Der p X은 정상인과 알러지 환자의 호중구 세포고사를 농도 순차적으로 억제시켰다. 호중구 세포고사 지연효과는 TLR4i, PP2, MyD88 억제제인MyD88i, LY294002, AKTi, PD98059에 의해 억제되었다. Der p X는 Lyn, AKT, ERK를 인산화시켰다. ERK의 활성은 TLR4i, PP2, LY294002, AKTi 에 의해 억제되었다. 반면에 MyD88i 는 Lyn, AKT, ERK인산화를 억제시키지 않았다. NF-кB 의 활성은 TLR4i, PP2, MyD88i, LY294002, AKTi, PD98059에 의해 억제되었다. 즉, 호중구 세포고사 지연은 TLR4, Lyn, PI3K, Akt, ERK, NF-кB와 TLR4, MyD88, NF-кB 신호 전달 체계를 통해 이루어졌고, 최종적으로는caspase 9와 caspase 3 활성 억제를 통해 이루어졌다. 이러한 발견을 통해 집먼지 진드기에 의한 호중구의 세포고사 조절기전을 이해하고, 더 나아가 알러지 질환의 병인기전 규명하는데 유용한 결과가 될 것이다.
집먼지 집드기는 알러지 비염, 천식, 아토피 피부염과 같은 질환을 유발하는 주요 알러젠이다. 알러지의 병인기전은 면역세포들의 사이토카인 분비와 호중구 세포고사 조절이상과 밀접한 연관이 있다. S100A8과 S100A9 단백질들 또한 염증성 질환을 유발하는 주요 단백질들이다. 위의 단백질들은 호중구와 단구의 세포질에 많이 존재하는 세포질 단백질이다. 이번 연구를 통해 집먼지 진드기가 면역세포들간의 어떤 상호작용을 하여 알러지를 유발시키는지 살펴보고, 더 나아가 TLR4에 결합하는 새로운 집먼지 진드기 단백질이 호중구 세포고사에 끼치는 영향을 알아보고자 했다. 파트 1에서는, 집먼지 진드기에 의해 림프구가 호중구 세포고사를 지연시키는 사이토카인을 방출하는지 여부와 그로 인해 호중구의 세포고사가 조절되는지 확인해 보았다. 호중구의 세포고사가 호중구와 림프구를 같이 배양만 시키면 약하게라도 지연되는 것을 확인하였다. 집먼지 진드기 추출물은 호중구에 단독으로 작용하는 것 보다, 림프구와 호중구의 공동배양에서 호중구 세포고사를 더 억제시켰다. 그 효과는 알러지 환자의 경우 더욱 크게 작용함을 보았다. 집먼지 진드기는 정상인과 알러지 환자의 림프구에서 호중구 세포고사를 지연시키는 사이토카인으로 알려진 IL-6, IL-8, MCP-1, GM-CSF의 분비를 증가시켰다. 집먼지 진드기에 의해 증가된 사이토카인은 protease activated receptor(PAR2)의 억제제인 PAR2i, PI3K의 억제제인 LY294002, AKT 억제제인 AKTi, ERK억제제인 PD98059, NF-кB 억제제인 BAY-11-7085에 의해서 감소하였다. 집먼지 진드기는에 의해 활성된 ERK는 PAR2i와 LY294002에 의해서 억제되었고, NF-кB활성은 PAR2i, LY294002, AKTi, PD98059에 의해 억제되었다. 정상인과 알러지 환자의 림프구에 집먼지 진드기를 처리하여 얻어진 사이토카인들은 caspase 9과 caspase 3 활성을 억제시킴으로 호중구의 세포고사를 지연시켰다. 이전 연구에서 집먼지 진드기에 의해 호중구와 단구의 세포질에 존재하는 단백질인 S100A8과 S100A9의 분비가 증가됨을 확인하였다. 파트 2에서는, S100A8과 S100A9 단백질이 정상인과 알러지 환자의 단구에 주는 활성이 호중구의 세포고사 조절에 끼치는 영향을 알아보았다. S100A8과 S100A9 단백질로 자극한 사람 단구 세포주(THP-1)의 상층액이 caspase 9 와 caspase 3 활성 억제시켜 호중구 세포고사를 지연시켰다. S100A8과S100A9 단백질은 사람 단구 세포주에서 호중구 세포고사 지연인자인MCP-1, IL-6, IL-8의 분비를 증가시켰다. S100A8과 S100A9 단백질에 의해 증가된 사이토카인은 toll-like receptor4의 억제제인 CLI-095, Src의 억제제인 PP2, PKCδ 억제제인 rottlerin, MAP kinase 억제제인 PD98059, SB202190, SP600125, NF-кB 억제제인 BAY-11-7085에 의해서 감소하였다. S100A8과 S100A9 단백질에 의해 활성화된 Src와 PKCδ는 CLI-095에 의해 억제되었고, ERK1/2, p38 MAPK, JNK의 활성은 CLI-095, PP2, rottlerin에 의해 억제되었다. S100A8과 S100A9 단백질은 NF-кB를 활성화 시키고, 이는 CLI-095, PP2, rottlerin, PD98059, SB202190, SP600125에 의해 억제되었다. 앞선 사람 단구 세포주의 실험 결과처럼, S100A8과 S100A9 단백질은 정상인과 알러지 환자의 단구에서 MCP-1, IL-6, IL-8의 분비를 증가시켰다. 증가된 사이토카인 분비는 TLR4, Src, PKCδ, ERK1/2, p38 MAPK, JNK, NF-кB의 신호전달체계를 통해 이루어졌다. 즉, S100A8과 S100A9단백질은 단구를 활성화시켜 사이토카인들의 분비를 증가시키고, 이로 인해 호중구 세포고사가 지연되었다. 파트 3에서, 집먼지 진드기의 단백질 성분들 중에서도TLR4에 결합하는 새로운 알러젠 단백질(Der p X)이 호중구의 세포고사 지연에 영향을 주는지 살펴보았다. Der p X은 정상인과 알러지 환자의 호중구 세포고사를 농도 순차적으로 억제시켰다. 호중구 세포고사 지연효과는 TLR4i, PP2, MyD88 억제제인MyD88i, LY294002, AKTi, PD98059에 의해 억제되었다. Der p X는 Lyn, AKT, ERK를 인산화시켰다. ERK의 활성은 TLR4i, PP2, LY294002, AKTi 에 의해 억제되었다. 반면에 MyD88i 는 Lyn, AKT, ERK인산화를 억제시키지 않았다. NF-кB 의 활성은 TLR4i, PP2, MyD88i, LY294002, AKTi, PD98059에 의해 억제되었다. 즉, 호중구 세포고사 지연은 TLR4, Lyn, PI3K, Akt, ERK, NF-кB와 TLR4, MyD88, NF-кB 신호 전달 체계를 통해 이루어졌고, 최종적으로는caspase 9와 caspase 3 활성 억제를 통해 이루어졌다. 이러한 발견을 통해 집먼지 진드기에 의한 호중구의 세포고사 조절기전을 이해하고, 더 나아가 알러지 질환의 병인기전 규명하는데 유용한 결과가 될 것이다.
House dust mite (HDM) is a main cause of allergic diseases such as allergic rhinitis, asthma, and atopic dermatitis. The pathogenic mechanism of allergy is linked to cytokine secretion of immune cells and dysregulation of neutrophil apoptosis. The S100A8 and S100A9 proteins play vital roles in infla...
House dust mite (HDM) is a main cause of allergic diseases such as allergic rhinitis, asthma, and atopic dermatitis. The pathogenic mechanism of allergy is linked to cytokine secretion of immune cells and dysregulation of neutrophil apoptosis. The S100A8 and S100A9 proteins play vital roles in inflammatory disease. Both proteins exist as cytosolic proteins in monocytes and neutrophils. In this study, I evaluated the function of HDM in the interaction between immune cells and neutrophils, and investigated the effect of a novel allergen binding to TLR4 on constitutive apoptosis of neutrophils. In part 1, I evaluated whether HDM enhances cytokine secretion of lymphocytes, which is concerned in regulation of constitutive neutrophil apoptosis. Spontaneous neutrophil apoptosis was a little inhibited by the culture of neutrophils and lymphocytes together. As the survival effect of Dermatophagoides pteronyssinus (DP) alone on neutrophils, DP suppressed neutrophil apoptosis in coculture of lymphocytes and neutrophils in normal subjects. DP more potently suppressed apoptosis of neutrophils cultured with lymphocytes together than neutrophils without lymphocytes in allergic subjects. In normal and allergic lymphocytes, extracts of HDM upregulated the production of IL-6, IL-8, MCP-1, and GM-CSF in a time-dependent manner. The cytokine release induced by HDM was decreased by PAR2i in a dose-dependent manner, as well as by LY294002, AKTi, PD98059, and BAY-11-7085. DP and Dermatophagoides farina (DF) induced ERK and NF-ҝB activation. The phosphorylation of ERK was blocked by PAR2i, LY294002 and AKTi, and NF-ҝB activation was suppressed by PAR2i, LY294002, AKTi, and PD98059. Supernatants collected from normal and allergic lymphocytes after DP stimulation suppressed the apoptosis of normal and allergic neutrophils via inhibition of caspase 9 and caspase 3 cleavage. In part 2, I examined whether S100A8 and S100A9 affect spontaneous neutrophil apoptosis by activating the monocytes in normal and allergic subjects. Supernatant collected from human monocytic THP-1 cells after stimulation with S100A8 and S100A9 inhibited normal neutrophil apoptosis by suppressing the cleavage of caspase 9 and caspase 3. Both S100A8 and S100A9 increased MCP-1, IL-6 and IL-8 secretion in THP-1 cells. This secretion was decreased by TLR4i, PP2, rottlerin, MAP kinase inhibitors, containing PD98059, SP600125 and SB202190, and BAY-11-7085. Src, PKCδ, ERK1/2, JNK, and p38 MAPK were activated by S100A8 and S100A9. The activation of Src and PKCδ was inhibited by TLR4i, and the phosphorylation of ERK1/2, JNK, and p38 MAPK was suppressed by TLR4i, PP2, and rottlerin. S100A8 and S100A9 triggered NF-ҝB activation, and the activation was inhibited by TLR4i, PP2, rottlerin, and MAPK kinase inhibitors. Both S100A8 and S100A9 enhanced the expression of MCP-1, IL-6, and IL-8 in normal and allergic monocytes. The cytokine release produced by S100A8 and S100A9 is associated with TLR4, Src, PKCδ, ERK1/2, JNK, p38 MAPK, and NF-ҝB. All the taken together, S100A8 and S100A9 act as anti-apoptotic factors on normal and allergic neutrophils by upregulating cytokine release of monocytes. In part 3, I evaluated the effect of a novel allergen, Der p X, derived from HDM on constitutive apoptosis of neutrophils. Recombinant Der p X inhibited neutrophil apoptosis in normal and allergic subjects. The anti- apoptotic effect of Der p X was inhibited by TLR4i, PP2, MyD88i, LY294002, AKTi, PD98059, and BAY11-7085. Lyn, AKT, and ERK were activated by Der p X. The phosphorylation of ERK was inhibited by TLR4i, PP2, LY294002, and AKTi. However, the phosphorylation of Lyn, AKT, and ERK were not suppressed by MyD88i. Anti-apoptotic signaling induced by Der p X is related to TLR4/Lyn/PI3K/AKT/ERK/NF-κB, and TLR4/MyD88 /NF-κB signaling pathway. Der p X delayed cleavage of caspase 9 and caspase 3. These findings enhance our understanding of the role of HDM in regulation of spontaneous neutrophil apoptosis in normal and allergic subjects and will facilitate explanation of the pathogenic mechanism of allergic diseases.
House dust mite (HDM) is a main cause of allergic diseases such as allergic rhinitis, asthma, and atopic dermatitis. The pathogenic mechanism of allergy is linked to cytokine secretion of immune cells and dysregulation of neutrophil apoptosis. The S100A8 and S100A9 proteins play vital roles in inflammatory disease. Both proteins exist as cytosolic proteins in monocytes and neutrophils. In this study, I evaluated the function of HDM in the interaction between immune cells and neutrophils, and investigated the effect of a novel allergen binding to TLR4 on constitutive apoptosis of neutrophils. In part 1, I evaluated whether HDM enhances cytokine secretion of lymphocytes, which is concerned in regulation of constitutive neutrophil apoptosis. Spontaneous neutrophil apoptosis was a little inhibited by the culture of neutrophils and lymphocytes together. As the survival effect of Dermatophagoides pteronyssinus (DP) alone on neutrophils, DP suppressed neutrophil apoptosis in coculture of lymphocytes and neutrophils in normal subjects. DP more potently suppressed apoptosis of neutrophils cultured with lymphocytes together than neutrophils without lymphocytes in allergic subjects. In normal and allergic lymphocytes, extracts of HDM upregulated the production of IL-6, IL-8, MCP-1, and GM-CSF in a time-dependent manner. The cytokine release induced by HDM was decreased by PAR2i in a dose-dependent manner, as well as by LY294002, AKTi, PD98059, and BAY-11-7085. DP and Dermatophagoides farina (DF) induced ERK and NF-ҝB activation. The phosphorylation of ERK was blocked by PAR2i, LY294002 and AKTi, and NF-ҝB activation was suppressed by PAR2i, LY294002, AKTi, and PD98059. Supernatants collected from normal and allergic lymphocytes after DP stimulation suppressed the apoptosis of normal and allergic neutrophils via inhibition of caspase 9 and caspase 3 cleavage. In part 2, I examined whether S100A8 and S100A9 affect spontaneous neutrophil apoptosis by activating the monocytes in normal and allergic subjects. Supernatant collected from human monocytic THP-1 cells after stimulation with S100A8 and S100A9 inhibited normal neutrophil apoptosis by suppressing the cleavage of caspase 9 and caspase 3. Both S100A8 and S100A9 increased MCP-1, IL-6 and IL-8 secretion in THP-1 cells. This secretion was decreased by TLR4i, PP2, rottlerin, MAP kinase inhibitors, containing PD98059, SP600125 and SB202190, and BAY-11-7085. Src, PKCδ, ERK1/2, JNK, and p38 MAPK were activated by S100A8 and S100A9. The activation of Src and PKCδ was inhibited by TLR4i, and the phosphorylation of ERK1/2, JNK, and p38 MAPK was suppressed by TLR4i, PP2, and rottlerin. S100A8 and S100A9 triggered NF-ҝB activation, and the activation was inhibited by TLR4i, PP2, rottlerin, and MAPK kinase inhibitors. Both S100A8 and S100A9 enhanced the expression of MCP-1, IL-6, and IL-8 in normal and allergic monocytes. The cytokine release produced by S100A8 and S100A9 is associated with TLR4, Src, PKCδ, ERK1/2, JNK, p38 MAPK, and NF-ҝB. All the taken together, S100A8 and S100A9 act as anti-apoptotic factors on normal and allergic neutrophils by upregulating cytokine release of monocytes. In part 3, I evaluated the effect of a novel allergen, Der p X, derived from HDM on constitutive apoptosis of neutrophils. Recombinant Der p X inhibited neutrophil apoptosis in normal and allergic subjects. The anti- apoptotic effect of Der p X was inhibited by TLR4i, PP2, MyD88i, LY294002, AKTi, PD98059, and BAY11-7085. Lyn, AKT, and ERK were activated by Der p X. The phosphorylation of ERK was inhibited by TLR4i, PP2, LY294002, and AKTi. However, the phosphorylation of Lyn, AKT, and ERK were not suppressed by MyD88i. Anti-apoptotic signaling induced by Der p X is related to TLR4/Lyn/PI3K/AKT/ERK/NF-κB, and TLR4/MyD88 /NF-κB signaling pathway. Der p X delayed cleavage of caspase 9 and caspase 3. These findings enhance our understanding of the role of HDM in regulation of spontaneous neutrophil apoptosis in normal and allergic subjects and will facilitate explanation of the pathogenic mechanism of allergic diseases.
주제어
#Allergy House dust mite Der p X Cytokine Neutrophil apoptosis Lymphocyte Monocyte
학위논문 정보
저자
Lee, Na Rae
학위수여기관
Graduate School, Eulji University
학위구분
국내박사
학과
임상병리학과 임상병리학
지도교수
김인식
발행연도
2018
총페이지
xvii, 149 p.
키워드
Allergy House dust mite Der p X Cytokine Neutrophil apoptosis Lymphocyte Monocyte
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