[학위논문]미생물 Myxococcus xanthus 유래 특이한 지방산화효소들의 특성 규명 및 다가불포화지방산들로부터 생리활성 옥시리핀 생물전환에의 응용 Characterization of unique lipoxygenases from bacterium Myxococcus xanthus and their application in the biotransformation of polyunsaturated fatty acids to bioactive oxylipins원문보기
옥시리핀 (Oxylipin)은 지방산화효소 (Lipoxygenase)의 생성물로써, 고등생물에서 신호전달 물질의 일종으로 다양한 생리활성에 관여한다. 특히, 동물에서 지방산화효소에 의해 전환된 옥시리핀은 류코트리엔, 프로스타글란딘, 헤폭실린, 트리오실린을 포함하는 지질 조절제이며, 항염증 및 ...
옥시리핀 (Oxylipin)은 지방산화효소 (Lipoxygenase)의 생성물로써, 고등생물에서 신호전달 물질의 일종으로 다양한 생리활성에 관여한다. 특히, 동물에서 지방산화효소에 의해 전환된 옥시리핀은 류코트리엔, 프로스타글란딘, 헤폭실린, 트리오실린을 포함하는 지질 조절제이며, 항염증 및 면역 반응과 밀접한 관련이 있다. 식물에서 지방산화효소에 의해 생성된 과산화지방산은 옥시리핀 생합성 효소에 의해 에폭시-, 수산화-, 케토-지방산 및 알데하이드로 전환되며, 이들은 외부 감염원에 대한 방어기작에 관여한다. 지방산화효소는 생체 내에서 옥시리핀 생합성의 출발효소이며, 비헴-철 효소로써, 지질과산화 효소군에 속한다. cis,cis-1,4-펜타디엔 구조를 가지는 다가불포화지방산으로부터 cis,trans-과산화지방산을 형성하는데 진핵생물에서 처음 발견되었으나, 최근 다양한 생물체에서 널리 보고되고 있다. 동물에 존재하는 몇몇의 지방산화효소는 기존의 과수산화반응 이외에도 과산화지방산을 기질로 에폭시화 반응을 촉매하여 류코트리엔, 헤폭실린과 같은 에폭시지방산을 생성할 수 있다. 지방산화효소는 기질의 종류에 따른 위치특이성에 따라 5-, 8-, 9-, 12-, 13-, 및 15-지방산화효소로 분류되며, 각각의 지방산화효소로부터 생성된 위치특이적 반응물은 생물체에서 다양한 생리활성기능을 가지기 때문에 특정 위치특이성을 가지는 지방산화효소를 확보하는 것은 매우 중요하다. 본 논문에서는 프로테오박테리아인 믹소코쿠스 잔투스 (Myxococcus xanthus)에서 특이한 위치특이성을 가지는 두 종류의 지방산화효소를 발견하였다. MXAN_1745 유전자로부터 발현된 지방산화효소는 아라키도네이트 12S-지방산화효소로 확인되었으며, 에이코사노이드의 탄소 9번 위치와 옥타데카노이드의 탄소 6번 위치에 작용하여 각각 12S-수산화지방산과 13S-수산화지방산을 생성하는 것을 확인하였으며, 에이코사노이드를 기질로하여 12S-형태의 반응물을 형성하는 것을 세균에서 처음으로 보고된 사례이다. 또한, 분자적인 접근을 통해, 아라키도네이트 12S-지방산화효소의 구조에서 위치특이성과 밀접한 관련이 있는 Thr397 잔기를 발견하였고, Thr 잔기를 Tyr로 치환하였을 때, 위치특이성이 변하는 것을 확인하였다. MXAN_1744 유전자로부터 발현된 다른 지방산화효소는 아라키도네이트 11S-지방산화효소로 확인되었으며, 전 생물체를 통틀어 본 연구에서 처음으로 보고되었다. 하지만 효소가 매우 불안정하여, 활성이 낮은 것으로 나타났다. 이 문제를 해결하기 위하여, 조절인자로 포스파티딜 콜린, Ca2+, 코토신 유사 단백질 (CLP)를 처리하여, 아라키도네이트 11S-지방산화효소의 안정성을 높이고, 이를 통해 효소 활성을 증가시켰다. 이 때, 사용한 CLP는 효모인 Rhodosporidium toluroides에서 발견하여 본 연구에서 처음 적용시켰다. 흥미롭게도 M. xanthus에서 발견한 두 가지 지방산화효소는 동물 유래 지방산화효소와 비슷하게 과수산화반응과 에폭시화 반응을 모두 촉매하였다. 더 나아가, M. xanthus를 다가불포화지방산이 포함된 배지에서 배양하여, 지질조절제의 존재를 확인하고, 이와 관련된 고리형산소화 효소와 에폭사이드가수분해 효소 또한 확보하였다. 이를 이용하여 최종적으로 생리활성을 가지는 옥시리핀의 생합성에 적용하였다. 그 결과, M. xanthus 유래 지방산화효소들과 에폭사이드 가수분해효소가 형질전환된 E. coli를 이용하여 에이코사노이드로부터 10종류의 헤폭실린과 트리오실린 유사체를 생합성할 수 있었으며, 그 중에서도 6종류는 신규한 물질로 각각 헤폭실린 B5, 헤폭실린 D3, 헤폭실린 E3, 트리오실린 B5, 트리오실린 D3, 및 트리오실린 E3로 명명하였다. 또한 생성된 반응물의 생리활성을 확인하였고, 총 6가지 물질이 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체에 대한 부분적인 길항제로써의 역할을 하였다. 또한, M. xanthus 유래 아라키도네이트 11S-지방산화효소와 에폭사이드 가수분해효소가 형질전환된 E. coli를 이용하여 옥타데카노이드들로부터 총 9가지의 식물 옥시리핀인 수산화지방산류, 에폭시수산화 지방산류, 및 삼수산화 지방산류를 성공적으로 생합성하였으며, 그 중에서 1종류의 에폭시수산화 지방산과, 2종류의 삼수산화 지방산은 신규 물질로 확인되었다. 전반적으로, 이러한 연구 결과는 앞으로 다양한 유기체에서의 옥시리핀의 생리학적 활성 연구를 용이하게 할 수 있으며, 생체활성 옥시리핀이 미생물 효소에 의한 전환될 수 있음을 시사한다.
옥시리핀 (Oxylipin)은 지방산화효소 (Lipoxygenase)의 생성물로써, 고등생물에서 신호전달 물질의 일종으로 다양한 생리활성에 관여한다. 특히, 동물에서 지방산화효소에 의해 전환된 옥시리핀은 류코트리엔, 프로스타글란딘, 헤폭실린, 트리오실린을 포함하는 지질 조절제이며, 항염증 및 면역 반응과 밀접한 관련이 있다. 식물에서 지방산화효소에 의해 생성된 과산화지방산은 옥시리핀 생합성 효소에 의해 에폭시-, 수산화-, 케토-지방산 및 알데하이드로 전환되며, 이들은 외부 감염원에 대한 방어기작에 관여한다. 지방산화효소는 생체 내에서 옥시리핀 생합성의 출발효소이며, 비헴-철 효소로써, 지질과산화 효소군에 속한다. cis,cis-1,4-펜타디엔 구조를 가지는 다가불포화지방산으로부터 cis,trans-과산화지방산을 형성하는데 진핵생물에서 처음 발견되었으나, 최근 다양한 생물체에서 널리 보고되고 있다. 동물에 존재하는 몇몇의 지방산화효소는 기존의 과수산화반응 이외에도 과산화지방산을 기질로 에폭시화 반응을 촉매하여 류코트리엔, 헤폭실린과 같은 에폭시지방산을 생성할 수 있다. 지방산화효소는 기질의 종류에 따른 위치특이성에 따라 5-, 8-, 9-, 12-, 13-, 및 15-지방산화효소로 분류되며, 각각의 지방산화효소로부터 생성된 위치특이적 반응물은 생물체에서 다양한 생리활성기능을 가지기 때문에 특정 위치특이성을 가지는 지방산화효소를 확보하는 것은 매우 중요하다. 본 논문에서는 프로테오박테리아인 믹소코쿠스 잔투스 (Myxococcus xanthus)에서 특이한 위치특이성을 가지는 두 종류의 지방산화효소를 발견하였다. MXAN_1745 유전자로부터 발현된 지방산화효소는 아라키도네이트 12S-지방산화효소로 확인되었으며, 에이코사노이드의 탄소 9번 위치와 옥타데카노이드의 탄소 6번 위치에 작용하여 각각 12S-수산화지방산과 13S-수산화지방산을 생성하는 것을 확인하였으며, 에이코사노이드를 기질로하여 12S-형태의 반응물을 형성하는 것을 세균에서 처음으로 보고된 사례이다. 또한, 분자적인 접근을 통해, 아라키도네이트 12S-지방산화효소의 구조에서 위치특이성과 밀접한 관련이 있는 Thr397 잔기를 발견하였고, Thr 잔기를 Tyr로 치환하였을 때, 위치특이성이 변하는 것을 확인하였다. MXAN_1744 유전자로부터 발현된 다른 지방산화효소는 아라키도네이트 11S-지방산화효소로 확인되었으며, 전 생물체를 통틀어 본 연구에서 처음으로 보고되었다. 하지만 효소가 매우 불안정하여, 활성이 낮은 것으로 나타났다. 이 문제를 해결하기 위하여, 조절인자로 포스파티딜 콜린, Ca2+, 코토신 유사 단백질 (CLP)를 처리하여, 아라키도네이트 11S-지방산화효소의 안정성을 높이고, 이를 통해 효소 활성을 증가시켰다. 이 때, 사용한 CLP는 효모인 Rhodosporidium toluroides에서 발견하여 본 연구에서 처음 적용시켰다. 흥미롭게도 M. xanthus에서 발견한 두 가지 지방산화효소는 동물 유래 지방산화효소와 비슷하게 과수산화반응과 에폭시화 반응을 모두 촉매하였다. 더 나아가, M. xanthus를 다가불포화지방산이 포함된 배지에서 배양하여, 지질조절제의 존재를 확인하고, 이와 관련된 고리형산소화 효소와 에폭사이드 가수분해 효소 또한 확보하였다. 이를 이용하여 최종적으로 생리활성을 가지는 옥시리핀의 생합성에 적용하였다. 그 결과, M. xanthus 유래 지방산화효소들과 에폭사이드 가수분해효소가 형질전환된 E. coli를 이용하여 에이코사노이드로부터 10종류의 헤폭실린과 트리오실린 유사체를 생합성할 수 있었으며, 그 중에서도 6종류는 신규한 물질로 각각 헤폭실린 B5, 헤폭실린 D3, 헤폭실린 E3, 트리오실린 B5, 트리오실린 D3, 및 트리오실린 E3로 명명하였다. 또한 생성된 반응물의 생리활성을 확인하였고, 총 6가지 물질이 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체에 대한 부분적인 길항제로써의 역할을 하였다. 또한, M. xanthus 유래 아라키도네이트 11S-지방산화효소와 에폭사이드 가수분해효소가 형질전환된 E. coli를 이용하여 옥타데카노이드들로부터 총 9가지의 식물 옥시리핀인 수산화지방산류, 에폭시수산화 지방산류, 및 삼수산화 지방산류를 성공적으로 생합성하였으며, 그 중에서 1종류의 에폭시수산화 지방산과, 2종류의 삼수산화 지방산은 신규 물질로 확인되었다. 전반적으로, 이러한 연구 결과는 앞으로 다양한 유기체에서의 옥시리핀의 생리학적 활성 연구를 용이하게 할 수 있으며, 생체활성 옥시리핀이 미생물 효소에 의한 전환될 수 있음을 시사한다.
The lipoxygenase (LOX) products, types of oxylipin, have wide range of biological activities as diverse signaling molecules in higher organisms. In particular, LOX-derived oxylipins in animals, called lipid mediators, including leukotrienes (LTs), prostaglandins (PGs), hepoxilins (HXs), and trioxili...
The lipoxygenase (LOX) products, types of oxylipin, have wide range of biological activities as diverse signaling molecules in higher organisms. In particular, LOX-derived oxylipins in animals, called lipid mediators, including leukotrienes (LTs), prostaglandins (PGs), hepoxilins (HXs), and trioxilins (TrXs), representatively, are significantly involved in anti-inflammatory and immune responses. In plant, hydroperoxy fatty acids (HPFAs) produced from LOXs are converted to epoxy-, hydroxy-, keto-fatty acids and aldehydes by other oxylipin enzymes, it participate in defense mechanisms from exogenous pathogens. LOX is the starting enzyme of oxylipin synthesis in vivo. LOX as non-heme iron enzyme belong to family of lipid peroxidation enzyme which catalyzes the oxygenation of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) containing one or several cis,cis-1,4-pentadiene units into cis,trans-HPFAs. At first, LOXs are reported only in eukaryotes. However, as more studies of oxylipins from various organisms proceed, LOXs also discovered from other organisms. In animals, LOXs also catalyze the epoxidation of HPFAs to epoxy hydroxy fatty acids (EHFAs) such as LTs and HXs. LOXs are classified as 5-, 8-, 12-, and 15-LOXs or 9- and 13- LOXs according to the number of oxygenated carbon site on arachidonic acid (ARA) and linoleic acid (LA), respectively. It is important to obtain a LOX with distinct regiospecificity because the regiospecific-products of LOX are shown different physiological activity in various organisms. In this thesis, two LOXs, having unique regiospecificities from Myxococcus xanthus, a proteobacterium, were investigated. The LOX expressed from the MXAN_1745 gene was identified as ARA 12S-LOX, catalyzed oxygenation at n-9 position in over C20 PUFAs to form 12S-HFAs and oxygenation at the n-6 position in C18 PUFAs to form 13S-HFAs. The 12S-form product of over C20 PUFAs is first reported of bacterial LOXs. Also, the residues involved in regiospecificity were determined to be Thr397. the regiospecificity of the T397Y variant for over C20 PUFAs was changed. Other LOX expressed from the MXAN_1744 gene was identified as ARA 11S-LOX for C20 and C22 PUFAs, it is the first reported from whole organisms. However, M. xanthus ARA 11S-LOX was unstable, it cause low activity. To solve this problem, phosphatidyl choline, Ca2+, and coactosin-like protein (CLP) as stimulatory factors were used to stabilization of enzyme and increase its activity. The CLP used in here was newly identified in the yeast Rhodosporidium toluroides. Interestingly, both LOXs from M. xanthus shown bi-functional activities of peroxidation and epoxidation, similar to mammalian LOXs. In addition, HX, TrX, and PG were identified from cultured wild M. xanthus with ARA, and related enzymes as cyclooxygenase and epoxide hydrolase (EH) could be found. These enzymes also reported first time in bacteria. Finally, the biotransformation pathway of bioactive oxylipins were designed using two LOXs and one EH of M. xanthus. As the results, ten types of HXs and TrXs as mammalian lipid mediators are succeed to produce from eicosanoids by recombinant E. coli expressing ARA 12S-LOX, ARA 11S-LOX, and EH from M. xanthus. Of which six types are newly identified, namely HXB5, HXD3, HXE3, TrXB5, TrXD3 and TrXE3. Also, biological activities of products were investigated that six types were determined potential peroxisome proliferator-activated receptor-γ partial agonist. Also, nine types of HFAs, EHFAs, and THFAs as plant oxylipins are produced from octadecanoids by recombinant E. coli expressing ARA 11S-LOX and EH from M. xanthus. Among them, one of EHFA and two of THFAs are discovered new compounds. Overall, these findings may facilitate physiological studies in various organisms and demonstrates bioactive oxylipins could be produced by microbial enzymes.
The lipoxygenase (LOX) products, types of oxylipin, have wide range of biological activities as diverse signaling molecules in higher organisms. In particular, LOX-derived oxylipins in animals, called lipid mediators, including leukotrienes (LTs), prostaglandins (PGs), hepoxilins (HXs), and trioxilins (TrXs), representatively, are significantly involved in anti-inflammatory and immune responses. In plant, hydroperoxy fatty acids (HPFAs) produced from LOXs are converted to epoxy-, hydroxy-, keto-fatty acids and aldehydes by other oxylipin enzymes, it participate in defense mechanisms from exogenous pathogens. LOX is the starting enzyme of oxylipin synthesis in vivo. LOX as non-heme iron enzyme belong to family of lipid peroxidation enzyme which catalyzes the oxygenation of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) containing one or several cis,cis-1,4-pentadiene units into cis,trans-HPFAs. At first, LOXs are reported only in eukaryotes. However, as more studies of oxylipins from various organisms proceed, LOXs also discovered from other organisms. In animals, LOXs also catalyze the epoxidation of HPFAs to epoxy hydroxy fatty acids (EHFAs) such as LTs and HXs. LOXs are classified as 5-, 8-, 12-, and 15-LOXs or 9- and 13- LOXs according to the number of oxygenated carbon site on arachidonic acid (ARA) and linoleic acid (LA), respectively. It is important to obtain a LOX with distinct regiospecificity because the regiospecific-products of LOX are shown different physiological activity in various organisms. In this thesis, two LOXs, having unique regiospecificities from Myxococcus xanthus, a proteobacterium, were investigated. The LOX expressed from the MXAN_1745 gene was identified as ARA 12S-LOX, catalyzed oxygenation at n-9 position in over C20 PUFAs to form 12S-HFAs and oxygenation at the n-6 position in C18 PUFAs to form 13S-HFAs. The 12S-form product of over C20 PUFAs is first reported of bacterial LOXs. Also, the residues involved in regiospecificity were determined to be Thr397. the regiospecificity of the T397Y variant for over C20 PUFAs was changed. Other LOX expressed from the MXAN_1744 gene was identified as ARA 11S-LOX for C20 and C22 PUFAs, it is the first reported from whole organisms. However, M. xanthus ARA 11S-LOX was unstable, it cause low activity. To solve this problem, phosphatidyl choline, Ca2+, and coactosin-like protein (CLP) as stimulatory factors were used to stabilization of enzyme and increase its activity. The CLP used in here was newly identified in the yeast Rhodosporidium toluroides. Interestingly, both LOXs from M. xanthus shown bi-functional activities of peroxidation and epoxidation, similar to mammalian LOXs. In addition, HX, TrX, and PG were identified from cultured wild M. xanthus with ARA, and related enzymes as cyclooxygenase and epoxide hydrolase (EH) could be found. These enzymes also reported first time in bacteria. Finally, the biotransformation pathway of bioactive oxylipins were designed using two LOXs and one EH of M. xanthus. As the results, ten types of HXs and TrXs as mammalian lipid mediators are succeed to produce from eicosanoids by recombinant E. coli expressing ARA 12S-LOX, ARA 11S-LOX, and EH from M. xanthus. Of which six types are newly identified, namely HXB5, HXD3, HXE3, TrXB5, TrXD3 and TrXE3. Also, biological activities of products were investigated that six types were determined potential peroxisome proliferator-activated receptor-γ partial agonist. Also, nine types of HFAs, EHFAs, and THFAs as plant oxylipins are produced from octadecanoids by recombinant E. coli expressing ARA 11S-LOX and EH from M. xanthus. Among them, one of EHFA and two of THFAs are discovered new compounds. Overall, these findings may facilitate physiological studies in various organisms and demonstrates bioactive oxylipins could be produced by microbial enzymes.
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