[학위논문]바이러스 기반의 새로운 SELEX를 이용한 독감바이러스 아형 특이적 진단법 개발 Development of a subtype-specific diagnostic system for influenza virus using a novel virus-based SELEX원문보기
권준영
(Pohang University of Science and Technology
Department of Life Sciences
국내박사)
압타머(Aptamer)는 표적 분자에 강한 친화력을 가진 DNA 또는 RNA 분자로 치료 및 진단 분야에서 각광받고 있는 분자이다. 압타머는 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 라고 불리는 시험 관내 선별 과정에 의해 생성된다. 압타머는 DNA 증폭 및 친화력 정제 단계를 포함하여 ...
압타머(Aptamer)는 표적 분자에 강한 친화력을 가진 DNA 또는 RNA 분자로 치료 및 진단 분야에서 각광받고 있는 분자이다. 압타머는 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 라고 불리는 시험 관내 선별 과정에 의해 생성된다. 압타머는 DNA 증폭 및 친화력 정제 단계를 포함하여 생체 외 생화학 공정에 의해 생산되므로 SELEX의 조건을 조정하여 원하는 특성을 보유한 압타머를 발굴할 수 있다. 예를 들어, 단백질 A 및 B와 상호 작용하는 압타머는 단백질 A 및 B (양성 - 양성 선별)를 사용한 두 번의 연속적인 양성 친화성 정제 단계에 의해 획득할 수 있다. 한편, 단백질 A에 결합하지만 단백질 B에 결합하지 않는 압타머는 단백질 A를 사용한 양성 친화성 정제 단계 및 단백질 B와의 음성 친화성 단계 (양성 - 음성 선별)에 의해 획득될 수 있다. 더욱이, 표적 단백질과 강한 친화력을 갖는 압타머는 변형핵산을 사용함으로써 획득할 수 있다. 진단 및 치료를 목적으로 하는 압타머의 표적 단백질은 대부분 막을 포함하고 있는 단백질이다. 막단백질의 경우 정제하기가 까다롭기 때문에 단백질의 세포 외 부분만 정제하여 사용하는 것이 대부분이다. 그러나 이런 경우에는 단백질의 구조가 제대로 형성되지 않거나, 실제 단백질에서는 볼 수 없는 인공적인 단면이 생기게 된다. 이런 상태의 단백질을 사용하여 압타머를 발굴하게 되면 실제 표적에는 결합하지 않는 압타머를 발굴할 확률이 높아진다. 이 연구에서는 효과적으로 막단백질에 대한 압타머를 발굴하기 위하여 ‘viro-SELEX’라는 이름의 새로운 바이러스 SELEX를 개발하였다. 인체에 유해하지 않으면서도 phosphorylation, glycosylation과 같은 번역 후 변형이 mammalian cell과 유사한 baculovirus의 표면에 표적 단백질을 발현시킨 대리바이러스를 제작하여 SELEX에 도입하였다. 또한 표적 단백질의 세포 외 부분을 발현 및 정제 한 것도 사용하여 압타머의 선택성을 높이고자 하였다. 새롭게 고안한 SELEX 방법을 평가해 보기 위하여 인플루엔자 바이러스 H3아형에 특이적으로 결합하는 압타머를 발굴해보고자 하였다. 이를 위해 baculovirus 발현 시스템을 사용하여 인플루엔자 바이러스의 외피단백질인 헤마글루티닌 단백질 (이하 HA3)의 세포 외 도메인을 발현 및 정제하고, 인플루엔자 바이러스의 HA3 단백질을 포함하는 대리 바이러스를 제작하고 정제하였다. 정제한 HA3 단백질과 HA3 대리바이러스를 연속적인 양성 SELEX 과정을 수행하여 압타머가 H3N2 인플루엔자 바이러스의 HA3에 결합하도록 했다. 또한 정제한 HA1, HA5 및 HA9 단백질의 세포 외 영역 부분을 정제하고, 대조군 대리 바이러스를 정제하여, 다른 아형의 인플루엔자 바이러스 및 바이러스 표면에 결합하는 압타머를 제거하였다. 이 새로운 SELEX 방법을 통하여 실제 인플루엔자 바이러스를 사용하지 않고도 실제 바이러스에 대하여 결합력과 특이성이 좋은 압타머들을 발굴할 수 있었다. 그리고 발굴한 압타머 중 한 쌍을 선별하여 인플루엔자 A 바이러스 H3N2 아형을 특이적으로 검출하는 측방 유동 분석 형의 진단시스템을 개발하였다. 압타머 기반의 H3N2 아형 특이적 검출한계는 0.102 HAU였으며 다른 아형의 인플루엔자 A 바이러스를 넣었을 때에는 검출신호를 보여주지 않는 것을 확인하였다. 요약하면, 이 연구에서는 막 단백질에 대한 압타머를 개발하는 방법으로써 baculovirus를 이용한 새로운 바이러스 기반의 SELEX를 방법 (viro-SELEX)을 보였다. 또한 이 방법을 사용하여 결합력과 특이성이 좋은 압타머 한 쌍을 선별하고 인플루엔자 A 바이러스 H3N2에 대한 아형 진단 시스템을 개발하였다. viro-SELEX 방법이 인플루엔자 A 바이러스뿐만 아니라 진단 및 치료를 목적으로 하는 표적에 대한 압타머를 발굴하는 방법으로써 세포 및 바이러스의 복잡한 막단백질을 정제하지 않고도 실제 표적에 높은 결합력을 보이는 압타머를 발굴하는데 사용될 것으로 기대한다.
압타머(Aptamer)는 표적 분자에 강한 친화력을 가진 DNA 또는 RNA 분자로 치료 및 진단 분야에서 각광받고 있는 분자이다. 압타머는 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 라고 불리는 시험 관내 선별 과정에 의해 생성된다. 압타머는 DNA 증폭 및 친화력 정제 단계를 포함하여 생체 외 생화학 공정에 의해 생산되므로 SELEX의 조건을 조정하여 원하는 특성을 보유한 압타머를 발굴할 수 있다. 예를 들어, 단백질 A 및 B와 상호 작용하는 압타머는 단백질 A 및 B (양성 - 양성 선별)를 사용한 두 번의 연속적인 양성 친화성 정제 단계에 의해 획득할 수 있다. 한편, 단백질 A에 결합하지만 단백질 B에 결합하지 않는 압타머는 단백질 A를 사용한 양성 친화성 정제 단계 및 단백질 B와의 음성 친화성 단계 (양성 - 음성 선별)에 의해 획득될 수 있다. 더욱이, 표적 단백질과 강한 친화력을 갖는 압타머는 변형핵산을 사용함으로써 획득할 수 있다. 진단 및 치료를 목적으로 하는 압타머의 표적 단백질은 대부분 막을 포함하고 있는 단백질이다. 막단백질의 경우 정제하기가 까다롭기 때문에 단백질의 세포 외 부분만 정제하여 사용하는 것이 대부분이다. 그러나 이런 경우에는 단백질의 구조가 제대로 형성되지 않거나, 실제 단백질에서는 볼 수 없는 인공적인 단면이 생기게 된다. 이런 상태의 단백질을 사용하여 압타머를 발굴하게 되면 실제 표적에는 결합하지 않는 압타머를 발굴할 확률이 높아진다. 이 연구에서는 효과적으로 막단백질에 대한 압타머를 발굴하기 위하여 ‘viro-SELEX’라는 이름의 새로운 바이러스 SELEX를 개발하였다. 인체에 유해하지 않으면서도 phosphorylation, glycosylation과 같은 번역 후 변형이 mammalian cell과 유사한 baculovirus의 표면에 표적 단백질을 발현시킨 대리바이러스를 제작하여 SELEX에 도입하였다. 또한 표적 단백질의 세포 외 부분을 발현 및 정제 한 것도 사용하여 압타머의 선택성을 높이고자 하였다. 새롭게 고안한 SELEX 방법을 평가해 보기 위하여 인플루엔자 바이러스 H3아형에 특이적으로 결합하는 압타머를 발굴해보고자 하였다. 이를 위해 baculovirus 발현 시스템을 사용하여 인플루엔자 바이러스의 외피단백질인 헤마글루티닌 단백질 (이하 HA3)의 세포 외 도메인을 발현 및 정제하고, 인플루엔자 바이러스의 HA3 단백질을 포함하는 대리 바이러스를 제작하고 정제하였다. 정제한 HA3 단백질과 HA3 대리바이러스를 연속적인 양성 SELEX 과정을 수행하여 압타머가 H3N2 인플루엔자 바이러스의 HA3에 결합하도록 했다. 또한 정제한 HA1, HA5 및 HA9 단백질의 세포 외 영역 부분을 정제하고, 대조군 대리 바이러스를 정제하여, 다른 아형의 인플루엔자 바이러스 및 바이러스 표면에 결합하는 압타머를 제거하였다. 이 새로운 SELEX 방법을 통하여 실제 인플루엔자 바이러스를 사용하지 않고도 실제 바이러스에 대하여 결합력과 특이성이 좋은 압타머들을 발굴할 수 있었다. 그리고 발굴한 압타머 중 한 쌍을 선별하여 인플루엔자 A 바이러스 H3N2 아형을 특이적으로 검출하는 측방 유동 분석 형의 진단시스템을 개발하였다. 압타머 기반의 H3N2 아형 특이적 검출한계는 0.102 HAU였으며 다른 아형의 인플루엔자 A 바이러스를 넣었을 때에는 검출신호를 보여주지 않는 것을 확인하였다. 요약하면, 이 연구에서는 막 단백질에 대한 압타머를 개발하는 방법으로써 baculovirus를 이용한 새로운 바이러스 기반의 SELEX를 방법 (viro-SELEX)을 보였다. 또한 이 방법을 사용하여 결합력과 특이성이 좋은 압타머 한 쌍을 선별하고 인플루엔자 A 바이러스 H3N2에 대한 아형 진단 시스템을 개발하였다. viro-SELEX 방법이 인플루엔자 A 바이러스뿐만 아니라 진단 및 치료를 목적으로 하는 표적에 대한 압타머를 발굴하는 방법으로써 세포 및 바이러스의 복잡한 막단백질을 정제하지 않고도 실제 표적에 높은 결합력을 보이는 압타머를 발굴하는데 사용될 것으로 기대한다.
Aptamers are DNA or RNA molecules with strong affinities to target molecules. Aptamers are generated by in vitro selection process called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). Usages of aptamers in therapeutic and diagnostic purposes are under investigation. Since aptame...
Aptamers are DNA or RNA molecules with strong affinities to target molecules. Aptamers are generated by in vitro selection process called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). Usages of aptamers in therapeutic and diagnostic purposes are under investigation. Since aptamers are produced by in vitro biochemical processes including DNA amplification and affinity purification steps, aptamers possessing a required character can be enriched by adjusting conditions of SELEX. For instance, aptamers interacting with both proteins A and B can be obtained by two consecutive positive affinity purification steps with proteins A and B (positive-positive selection). On the other hand, the aptamers binding to protein A but not to protein B can be obtained by a positive affinity purification step with protein A and a negative affinity step with protein B (positive-negative selection). Moreover, aptamers having strong affinities with a target protein can be obtained by using modified nucleosides (designated as advanced SELEX). In this study, a lateral flow assay system was develop to specifically detect influenza virus subtype H3N2 by using aptamers. For this objective, a novel virus-based SELEX named ‘viro-SELEX’ were devised and performed to enrich aptamers binding to the native form of influenza virus hemagglutinin 3 (HA3). In this new SELEX method, I expressed and purified the ectodomain of influenza HA3 protein using a baculovirus expression system. Moreover, surrogate baculovirus containing the full-length HA3 protein of influenza virus was constructed and purified. A consecutive positive SELEX processes with ecto-HA3 protein and surro-HA3 virus were performed to enrich aptamers binding to the native form of HA3 of influenza virus H3N2. Also negative affinity steps were performed with purified negative control baculovirus and purified proteins containing ectodomains of HA1, HA5 and HA9 to remove aptamers interacting with the negative control baculovirus and the HA proteins of other subtypes of influenza virus (H1N1, H5N1 and H7N9), respectively. A modified nucleoside (benzyl-U instead of T) was used in the viro-SELEX to obtain aptamers with high affinity. Finally, a pair of aptamers were obtained through this novel approach. This aptamer pair can bind to HA3 without any cross-competition activity. With the use of this aptamer pair, a lateral flow assay system which detects an influenza A virus subtype H3N2 was developed. The new aptamer-based subtype-specific diagnostic system of influenza virus was much more sensitive than a commercialized antibody-based subtype-specific diagnostic system of influenza virus. In summary, I devised a novel virus-based SELEX using baculovirus. Acquired aptamers generated from this new method showed high binding affinities and specificities. With this approach, I was able to develop an aptamer-based subtype-specific diagnostic system for influenza virus H3N2. Such accomplishment indicates that the viro-SELEX method is highly potential when developing aptamers against cellular and viral membrane proteins for diagnostic and therapeutic purposes.
Aptamers are DNA or RNA molecules with strong affinities to target molecules. Aptamers are generated by in vitro selection process called SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment). Usages of aptamers in therapeutic and diagnostic purposes are under investigation. Since aptamers are produced by in vitro biochemical processes including DNA amplification and affinity purification steps, aptamers possessing a required character can be enriched by adjusting conditions of SELEX. For instance, aptamers interacting with both proteins A and B can be obtained by two consecutive positive affinity purification steps with proteins A and B (positive-positive selection). On the other hand, the aptamers binding to protein A but not to protein B can be obtained by a positive affinity purification step with protein A and a negative affinity step with protein B (positive-negative selection). Moreover, aptamers having strong affinities with a target protein can be obtained by using modified nucleosides (designated as advanced SELEX). In this study, a lateral flow assay system was develop to specifically detect influenza virus subtype H3N2 by using aptamers. For this objective, a novel virus-based SELEX named ‘viro-SELEX’ were devised and performed to enrich aptamers binding to the native form of influenza virus hemagglutinin 3 (HA3). In this new SELEX method, I expressed and purified the ectodomain of influenza HA3 protein using a baculovirus expression system. Moreover, surrogate baculovirus containing the full-length HA3 protein of influenza virus was constructed and purified. A consecutive positive SELEX processes with ecto-HA3 protein and surro-HA3 virus were performed to enrich aptamers binding to the native form of HA3 of influenza virus H3N2. Also negative affinity steps were performed with purified negative control baculovirus and purified proteins containing ectodomains of HA1, HA5 and HA9 to remove aptamers interacting with the negative control baculovirus and the HA proteins of other subtypes of influenza virus (H1N1, H5N1 and H7N9), respectively. A modified nucleoside (benzyl-U instead of T) was used in the viro-SELEX to obtain aptamers with high affinity. Finally, a pair of aptamers were obtained through this novel approach. This aptamer pair can bind to HA3 without any cross-competition activity. With the use of this aptamer pair, a lateral flow assay system which detects an influenza A virus subtype H3N2 was developed. The new aptamer-based subtype-specific diagnostic system of influenza virus was much more sensitive than a commercialized antibody-based subtype-specific diagnostic system of influenza virus. In summary, I devised a novel virus-based SELEX using baculovirus. Acquired aptamers generated from this new method showed high binding affinities and specificities. With this approach, I was able to develop an aptamer-based subtype-specific diagnostic system for influenza virus H3N2. Such accomplishment indicates that the viro-SELEX method is highly potential when developing aptamers against cellular and viral membrane proteins for diagnostic and therapeutic purposes.
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