유전자 검출 기술의 발전으로 유전자 분자 진단은 이제 임상의학에서 빼놓을 수 없는 분야가 되었다. 특정 유전자와 질병의 연관성이 꾸준히 보고되면서, 유전자를 검출하는 것으로 해당 질병의 유무를 판단하거나 돌연변이를 확인하는 것이 가능해졌다. 질병 발병 후 검출 가능한 단백질 생물학적표지자 (biomarker)와 달리, 유전자 생물학적표지자는 질병 발병 초기에 미량의 유전자를 검출하는 것으로 조기 진단에 활용할 수 있다. 또한, 유전자 정량을 통해 치료에 따른 치료효과를 연속적으로 모니터링하면서 환자의 예후 판단의 근거로 활용할 수도 있다. 따라서 본 연구에서는, 더 민감하고 정확한 유전자 검출을 위해 산화그래핀 (graphene oxide) 또는 회전환 증폭 (...
유전자 검출 기술의 발전으로 유전자 분자 진단은 이제 임상의학에서 빼놓을 수 없는 분야가 되었다. 특정 유전자와 질병의 연관성이 꾸준히 보고되면서, 유전자를 검출하는 것으로 해당 질병의 유무를 판단하거나 돌연변이를 확인하는 것이 가능해졌다. 질병 발병 후 검출 가능한 단백질 생물학적표지자 (biomarker)와 달리, 유전자 생물학적표지자는 질병 발병 초기에 미량의 유전자를 검출하는 것으로 조기 진단에 활용할 수 있다. 또한, 유전자 정량을 통해 치료에 따른 치료효과를 연속적으로 모니터링하면서 환자의 예후 판단의 근거로 활용할 수도 있다. 따라서 본 연구에서는, 더 민감하고 정확한 유전자 검출을 위해 산화그래핀 (graphene oxide) 또는 회전환 증폭 (rolling circle amplification, RCA)을 이용한 새로운 유전자 검출 방법을 개발했고 이를 이용해 인플루엔자 바이러스와 암 유전자를 검출했다. 첫 번째 장에서는, 인플루엔자 바이러스 유전자를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 산화그래핀-중합효소연쇄반응 (graphene oxide-PCR, GO-PCR) 시스템을 개발했다. 산화그래핀은 그래핀 (graphene)을 산화시킨 탄소 단일 층 물질로 수소 결합을 통해 단일 가닥 핵산을 잘 흡착하고 근 거리의 형광을 소광하는 특성을 가지고 있다. 이러한 특성 덕분에 GO-PCR검출 시스템에서 이용하는 형광 프로브 DNA는 기존의 Taqman 프로브와 달리, 별도의 소광제 필요없이 더 높은 민감도 확보를 위한 길이 조절이 가능하다. GO-PCR을 통해 약 3.8 pg의 인플루엔자 바이러스 RNA를 검출했고, 신호 대비 바탕값 비율이 약 3.3임을 확인했다. 또한, 이러한 결과가 기존의 SYBR green 기반의 실시간 중합효소연쇄반응과 비교했을 때 각각 약 2배, 1.6배 뛰어난 것임을 확인했다. 두 번째 장에서는 혈장 내 존재하는 표피 성장 인자수용체 (epidermal growth factor receptor) 엑손 19 결실 (mutation) 돌연변이를 검출할 수 있는 GO-PCR 시스템을 개발했다. 기존의 Taqman 프로브보다 길이가 2배이상 증가된 형광 프로브 DNA (80 mer)를 사용한 GO-PCR을 통해 약 41 pg의 돌연변이 DNA를 검출할 수 있었고, 야생형 DNA와의 혼합물에서 0.1%의 돌연변이 DNA를 검출했다. 이는 Taqman 프로브 기반 실시간 중합효소연쇄반응보다 각각 약 10배, 50배 뛰어난 것이며, 야생형 DNA와의 혼합물 내 25%의 돌연변이 DNA를 구별할 수 있는 염기서열분석법 (sequencing)보다 약 250배 뛰어난 것이다. 하지만 GO-PCR 시스템은 신호 대비 바탕값 비율이 3~4정도로 낮아 민감도를 증가시키는데 한계가 있었다. 따라서 세 번째 장에서는 유전자 증폭효율이 좋은 회전환 증폭과 PCR을 결합한 새로운 검출 시스템을 개발했다. 반복되는 구아닌 사중나선 구조를 생성하는 이중 증폭 방법을 통해 인플루엔자 바이러스 RNA를 2.5시간 내 약 4.9 aM까지 검출했으며, 3가지 타입의 인플루엔자 바이러스 유전자형에 대한 신호 대비 바탕값 평균이 11.2임을 확인했다. 그리고 이 결과가 민감도 측면에서 혈구응집반응 (hemagglutination assay)보다 약 256배, SYBR green 기반의 실시간 중합효소연쇄반응보다 약 1000배 향상된 것임을 확인했다. 마지막 장에서는 PCR과 구아닌 사중나선 구조를 생성하는 회전환 증폭에 Taq 리가아제 (ligase)를 이용하여 백혈병 환자에게서 자주 발견되는 단일염기 돌연변이 (single nucleotide mutation, SNM)를 검출할 수 있는 형광 검출 시스템을 개발했다. 단일염기 돌연변이는 암의 약물 내성에 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있어 적절한 약물의 선택과 개인 맞춤형 치료 등에 중요하다. 민감하고 정확한 형광 검출 시스템을 통해 약 8.0 fg의 돌연변이 RNA를 검출했고 야생형 유전자와의 혼합물 내 0.53%의 돌연변이 RNA를 검출했다. 또한, 6종의 단일염기 돌연변이를 96-well plate에서 다중 검출했으며, 환자 유래 샘플에 적용 가능함도 확인했다. 정리하자면, 본 연구는 산화그래핀과 핵산 프로브, 다양한 유전자 증폭법 등을 이용하여 바이러스 유전자와 발암 유전자를 민감하고 정확하게 검출할 수 있는 새로운 유전자 분자 진단 시스템을 개발한 것이다. 첫 번째로, 산화그래핀-중합효소연쇄반응 시스템을 통해 인플루엔자 바이러스 RNA와 혈장 내 폐암 돌연변이 유전자를 각각 형광 검출했다. 두 번째로 구아닌 사중나선 구조를 생성하는 회전환 증폭을 이용하여 3종의 인플루엔자 바이러스 RNA를 매우 민감하게 검출했다. 세 번째로, 서열 특이적 DNA 접합과 회전환 증폭을 이용하여 6종의 백혈병 단일염기 돌연변이를 정확하게 형광 검출했다. 이러한 연구 결과는 유전자 분자 진단 분야에 새로운 검출 전략 개발을 위한 단서가 될 수 있을 것이며, 나아가 질병의 조기진단 및 질병 특성에 맞는 적절한 치료 등에 이용되어 맞춤의학을 미래에 가능하게 함으로써 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있을 것이다.
유전자 검출 기술의 발전으로 유전자 분자 진단은 이제 임상의학에서 빼놓을 수 없는 분야가 되었다. 특정 유전자와 질병의 연관성이 꾸준히 보고되면서, 유전자를 검출하는 것으로 해당 질병의 유무를 판단하거나 돌연변이를 확인하는 것이 가능해졌다. 질병 발병 후 검출 가능한 단백질 생물학적표지자 (biomarker)와 달리, 유전자 생물학적표지자는 질병 발병 초기에 미량의 유전자를 검출하는 것으로 조기 진단에 활용할 수 있다. 또한, 유전자 정량을 통해 치료에 따른 치료효과를 연속적으로 모니터링하면서 환자의 예후 판단의 근거로 활용할 수도 있다. 따라서 본 연구에서는, 더 민감하고 정확한 유전자 검출을 위해 산화그래핀 (graphene oxide) 또는 회전환 증폭 (rolling circle amplification, RCA)을 이용한 새로운 유전자 검출 방법을 개발했고 이를 이용해 인플루엔자 바이러스와 암 유전자를 검출했다. 첫 번째 장에서는, 인플루엔자 바이러스 유전자를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 산화그래핀-중합효소연쇄반응 (graphene oxide-PCR, GO-PCR) 시스템을 개발했다. 산화그래핀은 그래핀 (graphene)을 산화시킨 탄소 단일 층 물질로 수소 결합을 통해 단일 가닥 핵산을 잘 흡착하고 근 거리의 형광을 소광하는 특성을 가지고 있다. 이러한 특성 덕분에 GO-PCR검출 시스템에서 이용하는 형광 프로브 DNA는 기존의 Taqman 프로브와 달리, 별도의 소광제 필요없이 더 높은 민감도 확보를 위한 길이 조절이 가능하다. GO-PCR을 통해 약 3.8 pg의 인플루엔자 바이러스 RNA를 검출했고, 신호 대비 바탕값 비율이 약 3.3임을 확인했다. 또한, 이러한 결과가 기존의 SYBR green 기반의 실시간 중합효소연쇄반응과 비교했을 때 각각 약 2배, 1.6배 뛰어난 것임을 확인했다. 두 번째 장에서는 혈장 내 존재하는 표피 성장 인자 수용체 (epidermal growth factor receptor) 엑손 19 결실 (mutation) 돌연변이를 검출할 수 있는 GO-PCR 시스템을 개발했다. 기존의 Taqman 프로브보다 길이가 2배이상 증가된 형광 프로브 DNA (80 mer)를 사용한 GO-PCR을 통해 약 41 pg의 돌연변이 DNA를 검출할 수 있었고, 야생형 DNA와의 혼합물에서 0.1%의 돌연변이 DNA를 검출했다. 이는 Taqman 프로브 기반 실시간 중합효소연쇄반응보다 각각 약 10배, 50배 뛰어난 것이며, 야생형 DNA와의 혼합물 내 25%의 돌연변이 DNA를 구별할 수 있는 염기서열분석법 (sequencing)보다 약 250배 뛰어난 것이다. 하지만 GO-PCR 시스템은 신호 대비 바탕값 비율이 3~4정도로 낮아 민감도를 증가시키는데 한계가 있었다. 따라서 세 번째 장에서는 유전자 증폭효율이 좋은 회전환 증폭과 PCR을 결합한 새로운 검출 시스템을 개발했다. 반복되는 구아닌 사중나선 구조를 생성하는 이중 증폭 방법을 통해 인플루엔자 바이러스 RNA를 2.5시간 내 약 4.9 aM까지 검출했으며, 3가지 타입의 인플루엔자 바이러스 유전자형에 대한 신호 대비 바탕값 평균이 11.2임을 확인했다. 그리고 이 결과가 민감도 측면에서 혈구응집반응 (hemagglutination assay)보다 약 256배, SYBR green 기반의 실시간 중합효소연쇄반응보다 약 1000배 향상된 것임을 확인했다. 마지막 장에서는 PCR과 구아닌 사중나선 구조를 생성하는 회전환 증폭에 Taq 리가아제 (ligase)를 이용하여 백혈병 환자에게서 자주 발견되는 단일염기 돌연변이 (single nucleotide mutation, SNM)를 검출할 수 있는 형광 검출 시스템을 개발했다. 단일염기 돌연변이는 암의 약물 내성에 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있어 적절한 약물의 선택과 개인 맞춤형 치료 등에 중요하다. 민감하고 정확한 형광 검출 시스템을 통해 약 8.0 fg의 돌연변이 RNA를 검출했고 야생형 유전자와의 혼합물 내 0.53%의 돌연변이 RNA를 검출했다. 또한, 6종의 단일염기 돌연변이를 96-well plate에서 다중 검출했으며, 환자 유래 샘플에 적용 가능함도 확인했다. 정리하자면, 본 연구는 산화그래핀과 핵산 프로브, 다양한 유전자 증폭법 등을 이용하여 바이러스 유전자와 발암 유전자를 민감하고 정확하게 검출할 수 있는 새로운 유전자 분자 진단 시스템을 개발한 것이다. 첫 번째로, 산화그래핀-중합효소연쇄반응 시스템을 통해 인플루엔자 바이러스 RNA와 혈장 내 폐암 돌연변이 유전자를 각각 형광 검출했다. 두 번째로 구아닌 사중나선 구조를 생성하는 회전환 증폭을 이용하여 3종의 인플루엔자 바이러스 RNA를 매우 민감하게 검출했다. 세 번째로, 서열 특이적 DNA 접합과 회전환 증폭을 이용하여 6종의 백혈병 단일염기 돌연변이를 정확하게 형광 검출했다. 이러한 연구 결과는 유전자 분자 진단 분야에 새로운 검출 전략 개발을 위한 단서가 될 수 있을 것이며, 나아가 질병의 조기진단 및 질병 특성에 맞는 적절한 치료 등에 이용되어 맞춤의학을 미래에 가능하게 함으로써 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있을 것이다.
Due to the advances in gene detection technologies, molecular gene diagnosis has become indispensable in the field of clinical medicine. Since a close relationship between gene sequence and a disease has been reported, detection of the genetic biomarker has been used for not only detection of the di...
Due to the advances in gene detection technologies, molecular gene diagnosis has become indispensable in the field of clinical medicine. Since a close relationship between gene sequence and a disease has been reported, detection of the genetic biomarker has been used for not only detection of the disease but also identification of genetic mutations. Unlike protein biomarkers that can be usually detected after the onset of the disease, genetic biomarkers can be used for early diagnosis by detecting trace amount of target gene sequence at the early stage of disease. In addition, molecular gene diagnosis has a good potential of continuous monitoring to determine patient’s prognosis after treatment through quantitative analysis of the target gene. Throughout my doctorate studies, I developed novel gene detection systems using either nucleic acid adsorbing carbon material (i.e. graphene oxide) or isothermal gene amplification (i.e. rolling circle amplification). High sensitivity and selectivity of these genetic diagnosis systems were validated by applying the system to detect viral genes and oncogenes.
Due to the advances in gene detection technologies, molecular gene diagnosis has become indispensable in the field of clinical medicine. Since a close relationship between gene sequence and a disease has been reported, detection of the genetic biomarker has been used for not only detection of the disease but also identification of genetic mutations. Unlike protein biomarkers that can be usually detected after the onset of the disease, genetic biomarkers can be used for early diagnosis by detecting trace amount of target gene sequence at the early stage of disease. In addition, molecular gene diagnosis has a good potential of continuous monitoring to determine patient’s prognosis after treatment through quantitative analysis of the target gene. Throughout my doctorate studies, I developed novel gene detection systems using either nucleic acid adsorbing carbon material (i.e. graphene oxide) or isothermal gene amplification (i.e. rolling circle amplification). High sensitivity and selectivity of these genetic diagnosis systems were validated by applying the system to detect viral genes and oncogenes.
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