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병원체를 포함하는 감염성 물질의 검출 기술은 다양한 기술과 접목되어 많은 연구자들을 통해 개발되어 많은 분야에서 활용되고 있다. 최근 들어, 분자생물학적인 기술 기반의 검출 방법들이 급부상하고 있으며, 그 중에서도 핵산을 증폭하는 기술이 RNA 및 DNA를 유전체로 지니는 병원체들의 검출에 주로 활용되고 있다.
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병원체를 포함하는 감염성 물질의 검출 기술은 다양한 기술과 접목되어 많은 연구자들을 통해 개발되어 많은 분야에서 활용되고 있다. 최근 들어, 분자생물학적인 기술 기반의 검출 방법들이 급부상하고 있으며, 그 중에서도 핵산을 증폭하는 기술이 RNA 및 DNA를 유전체로 지니는 병원체들의 검출에 주로 활용되고 있다.
Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 기술은 등온에서 핵산을 증폭시킬 수 있으며, 매우 적은 양의 표적 물질이 존재하더라도 증폭이 가능할 정도로 높은 민감도를 지닌다. 또한 이 기술은 표적 부위에 총 여섯 부위에 결합하는 특이적인 프라이머를 활용하기 때문에 특이성 또한 높은 것으로 알려져 있다. PCR 기술로부터 파생된 실시간 PCR(Real-time PCR) 기술은 일상적으로 활용되고 있으나, LAMP는 이와 비교하여 짧은 시간 내에 핵산을 대량으로 증폭시킬 수 있다는 점이 강조되고 있다. 그뿐만 아니라 LAMP는 온도 변화나 형광 측정을 위한 값비싼 기기와 결과에 대한 전문가의 분석이 필요하지 않다. 이러한 특징들은 병원체의 일차적인 스크리닝이 필수적인 상황에서 LAMP 기술이 충분히 활용될 수 있다는 걸 알려준다. 본 논문에서는 총 세 가지의 감염성 병원체의 검출을 위하여 LAMP 기술을 도입하였으며, 등온 조건에서 각 병원체의 유전체를 검출하고 현장에서도 충분히 활용될 수 있도록 여러 방법들을 고안하였다.
Chapter II에서는, 식물체에만 감염되어 질병을 유발하는 바이로이드 중에서도 사과, 체리 등에 감염하는 Apple scar skin viroid (ASSVd)의 검출에 대한 연구를 진행하였다. ASSVd를 포함한 바이로이드 전체는 어떠한 단백질도 암호화하지 않으며 오로지 RNA로만 구성되어 있다. 때문에 항체 등의 단백질을 활용하는 기술로는 검출할 수가 없어, 역전사(Reverse Transcription, 이하 RT) 기반의 LAMP 기술의 도입은 효용성이 크다고 판단하였다. 감염된 나뭇잎에서 추출된 RNA는 Sequencing과 PCR 기술로 검증되었다. 또한 분석된 서열 정보를 바탕으로 LAMP primer가 구축되었고, 반응 조건들이 최적화되었다. 감염된 잎에서 추출한 RNA에서 직접 ASSVd의 검출을 수행하기 위해, 63 °C에서 30분 동안 LAMP 반응을 수행하여 기술의 효용성을 검증하였다. 또한 LAMP의 가장 큰 난점이라고 할 수 있는 비특이적인 반응(Non-specific primer amplification, 이하 NSPA로 지칭) 산물을 실제 LAMP 산물과 비교할 수 있는 몇 가지의 방법들을 고안하였으며, 그 방법들은 다음과 같다. Agarose gel 전기영동의 밴드 패턴 분석, Real-time LAMP를 통한 curve 분석, LAMP의 특이적인 부위에 적용되는 Barcoding probe 등의 실험을 수행하였다.
Chapter III에서는, 낙타와 사람에게 모두 감염성 질환을 유발하는 인수공통전염병인 중동호흡기증후군 (Middle East respiratory syndrome)의 유발 바이러스인 MERS-CoV의 검출에 대한 연구를 서술하였다. RNA에서 직접 LAMP를 수행하는 역전사 기반의 LAMP를 microchamber내에서 수행하고 검출 결과를 간편하게 확인할 수 있는 One-pot RT-LAMP 검출 시스템을 구축하였다. 반응 온도, 시간 및 구성 물질들의 농도 조건 등의 LAMP 조건들이 최적화되었고, 결정된 조건 하에서 RT-LAMP 기법은 기존에 주로 활용되고 있는 기법들과 비교되었다. 이렇게 최적화 및 검증된 검출 기법의 조건들은 결과의 확인을 위해 형광 물질인 EvaGreen과 함께 플라스틱으로 된 작은 마이크로챔버(microchamber)에 적용되었다. 최종적으로 구성된 One-pot RT-LAMP 검출 시스템에 대하여, MERS-CoV의 RNA를 활용하여 민감도가 확인되었고 다른 호흡기 바이러스 시료를 활용해 특이성이 확인되었다. 기존에 MERS-CoV를 검출하기 위한 기법은 Sequencing과 qRT-PCR이 공식적으로 제시되고 있다. 그러나 두 기술 모두 정확하고 고감도의 기버이지만 값비싼 기기와 전문적인 분석이 필요하며 현장에서 활용되기엔 몇 가지의 한계가 따른다. 따라서 본 연구에서 개발된 검출 시스템은 현장과 가까운 간이 실험실이나 자원이 부족한 곳에서 그 효용성이 극대화 될 것이라 판단되었다.
Chapter IV에서는, 배나무를 포함한 다양한 식물 숙주에 White root rot (WRR) disease를 유발하는 Rosellinia necatrix의 검출 과정과 감염이 의심되는 나무에 대한 일차적인 진단 기준을 확립하기 위한 연구 내용들이 서술되었다. R. necatrix는 나무의 뿌리의 접촉 혹은 토양으로 확산되며, 나무의 뿌리 부위가 어느 부분으로 자라나는 지 알 수 없고 땅 깊숙한 곳에 존재하기 때문에 감염의 포인트를 찾기 위해서는 다량의 시료에 대한 진단이 필요하다. 또한 소량의 R. necatirx가 토양에 남아 있다가 이후에 심어지는 묘목에 감염될 수 있기 때문에 토양에 대한 초기 스크리닝이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 다량의 흙 시료에서 R. necatrix의 검출을 신속하게 수행할 수 있도록 LAMP 기술을 도입하였다. 먼저, NCBI 기반의 서열 정보를 기반으로 구성된 표적 부위와 이 부위 내에서 구축된 LAMP primer가 증폭 효율 비교를 통해 최종적으로 선정되었다. LAMP의 조건들이 최적화되었고, 이를 R. necatrix의 존재가 두 가지 방법을 통해 확인된 현장 시료에 도입하여 그 효용성도 검증하였다. 또한 다량의 시료에 대한 결과를 편리하게 판단할 수 있도록 값싼 재료를 활용한 종이 기반의 devices를 개발하여 LAMP 기술과 접목하였다. 종이 디바이스 (Turn-on fluorescent paper devices, 이하 ToFP devices)는 도입된 형광 물질인 SYBR green I의 농도 조건을 최적화하고, 디바이스 내의 각 홀 영역의 독립성과 형광 신호의 균일성도 확인하였다. 최종적으로 구축된 LAMP 기반의 ToFP device의 현장 활용성은 현장에서 얻어 3번의 검증을 통해 선정된 14개의 양성 현장 흙 시료를 활용해 확인되었다. 검출의 현장 효용성을 극대화시키기 위해, 흙 시료에서 복잡한 과정 없이 DNA를 추출하여 바로 LAMP에 적용하는 방법이 고안되었고, 이를 LAMP 기반의 ToFP device 검출 시스템과 함께 활용하여 흙 시료에 대한 블라인드 테스트를 수행하였다. 수행 결과, 13개 흙 시료에 대한 R. necatrix의 검출은 1시간 50분 만에 수행되었고, 그 결과 또한 기존 추출 기술을 활용하여 진행되는 검출 기법과 많은 차이를 보이지 않았다. 확실한 비 감염 나무 4그루와 감염 나무 3그루의 흙 시료와 개발된 검출 시스템을 활용하여 WRR disease의 질병의 진단을 위한 감염과 비 감염, 부가적인 진단 과정이 필요한 나무의 분별을 위한 일차적인 진단 기준을 확립하였다.
상기 서술된 감염성 병원체를 검출하기 위한 기법들은 LAMP 기술을 기반으로 하여 고감도의, 신속한 검출을 위해 개발되었으며, 경제적인 효율성 또한 고려되었다. 또한 다른 기술과의 상승적인 접목을 통해 현장 시료에 대한 적용성이 극대화되었고 실제 감염 시료들이 도입되어 검출 시스템의 효용성이 검증되었다.
이처럼, 본 연구에서는 핵산 등온 증폭 기술인 LAMP 기반의 검출 시스템에 대하여 연구하였고, 현장 활용성을 검증함으로써, 감염성 병원체의 신속하고 간편한 진단을 위한 기반 기술로의 활용 가능성을 제시하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Detection techniques for infectious disease causal agents, included viroid, viral, bacterial, and fungal pathogens, have been developed by many researchers and utilized in a number of fields. Recently, detection based on molecular biological technologies has continuously been being emerged, and nucl...

Detection techniques for infectious disease causal agents, included viroid, viral, bacterial, and fungal pathogens, have been developed by many researchers and utilized in a number of fields. Recently, detection based on molecular biological technologies has continuously been being emerged, and nucleic acid amplification technologies have being mainly used for the detection of pathogens contained RNA or DNA as the genome. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique is one of the most innovative nucleic acids amplification because the advantages of the technique include simple use, high specificity and sensitivity and short reaction time. In this study, the enhanced LAMP-based techniques were integrated to establish a useful detection system for infectious pathogens and were inspected for application on the field.
In the first phase of this study, detecting Apple scar skin viroid (ASSVd) causing large losses in a farmhouse, was performed based on one-step reverse transcription (RT)-LAMP in the infected leaf sample. Polymerase chain reaction (PCR) and sequencing analysis were carried out to verify ASSVd-infected Hongro leaf samples. LAMP primer set was constructed based on the obtained ASSVd genome (310 nt) and the reaction conditions such as primer concentrations, reaction time and temperature were optimized to apply directly total RNA from infected leaf samples. In addition, to distinguish the true LAMP reaction to non-specific primers amplification (NSPA), which could cause false-positive results, have been devised various methods; Analysis of the band patterns of agarose gel electrophoresis, Fluorescence and melting curve analysis of the real-time LAMP, Barcoding probe applied to the specific region of the LAMP products. Second, the Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV), which causes an infectious zoonosis disease, was detected by amplifying specific regions in the genome with RT-LAMP in a microchamber. LAMP primers were designed in the nucleocapsid protein-encoded gene of the virus and LAMP conditions were optimized. The plastic microchamber was considered a detection platform with fluorescent reagents (10× EvaGreen) to perform one-pot reactions containing RT, LAMP, and observation of the results. Also, the one-pot RT-LAMP detection system was suggested to enable the use of simpler equipment and uncomplicated protocols. Finally, this study was carried out to detect the Rosellinia necatrix, which causes white root rot (WRR) disease infecting the pear trees. The diseased trees were also shown to white mycelium in roots, drooping leaves, and eventually withering the trees as disease signs. Constructed primers and optimum LAMP conditions including temperature and reaction time were applied to infected soil samples verified with PCR and metagenomic analysis. Turn-on fluorescent paper (ToFP) devices were developed to observe and analyze the results of LAMP. The fluorescence-based paper detector was constructed with paper materials containing glass fiber paper and was validated its simplicity and efficacy for on-site application by applying to the infected, non-infected, and suspected soil samples. The results were foundational to establish the criteria for the primary diagnosing of WRR disease via detection for the soil around pear trees.
All the studies described in this thesis suggested that the detection systems based on the isothermal nucleic acids amplification technique, called LAMP, can be utilized as a convenient tool for a simple and rapid diagnosis for the viroid, virus, and fungus pathogens causing infectious diseases.

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