[학위논문]Exploration of antimicrobial mode of action of periplanetasin-4 from Periplaneta americana : 미국 바퀴벌레 유래 항균 펩타이드 Periplanetasin-4의 작용기전에 대한 연구원문보기
(초 록) 유해 곤충 중 하나인 바퀴벌레는 많은 종들이 인간과 밀접하게 접촉하여 생활하고 있습니다. 비위생적인 생활 방식으로 인해 유해 물질을 인간에게 옮길 수 있습니다. Periplanetasin-4 (LRHKVYGYCVLGP-NH2)는 미국 바퀴벌레인 Periplaneta americana에서 유래한 13-mer 펩타이드입니다. 인간 적혈구에 대한 항균 및 세포 독성 효과를 평가하기 위해, 미생물의 최소 저해농도, 용혈 활성 및 wjwtks ...
(초 록) 유해 곤충 중 하나인 바퀴벌레는 많은 종들이 인간과 밀접하게 접촉하여 생활하고 있습니다. 비위생적인 생활 방식으로 인해 유해 물질을 인간에게 옮길 수 있습니다. Periplanetasin-4 (LRHKVYGYCVLGP-NH2)는 미국 바퀴벌레인 Periplaneta americana에서 유래한 13-mer 펩타이드입니다. 인간 적혈구에 대한 항균 및 세포 독성 효과를 평가하기 위해, 미생물의 최소 저해농도, 용혈 활성 및 wjwtks 탈수소 효소 (lactate dehydrogenase, LDH) 방출 분석을 수행하였습니다. Periplanetasin-4는 헤모글로빈 및 LDH의 방출을 유도하지 않고 광범위한 항균 활성을 나타냈다. 대표적인 병원성 진균인 Candida albicans를 대상으로 하여 세포내 작용기전을 조사하였습니다. Periplanetasin-4는 막 투과성 및 탈분극의 증가와 막 역학의 변화를 통해 세포막을 파괴하여 2.3 nm의 크기의 세포 내 내용물을 통과시킬 수 있습니다. 또한, periplanetasin-4에 노출 된 세포는 반응성 산소 종 (reactive oxygen species, ROS) 및 산화된 불포화 지방산을 축적시켰다. 곰팡이 세포에서, 다양한 소기관-소기관 간의 상호작용은 세포 생존에 필수적인 역할을 합니다. 미토콘드리아와 액포 사이의 상호작용은 세포 내 신호 전달 혹은 생존에 중요한 역할을 합니다. 이 연구에서, 세포 사멸 특징인 막 손상 및 무의미한 DNA 단편화와의 자가사멸기작 활성화를 확인하였습니다. 직접적인 DNA 손상이 없는 세포 자멸 적 특징은 periplanetasin-4가 DNA와 직접 상호 작용하지 않았으며 미토콘드리아 및 액포의 기능 장애를 나타냈다는 증거를 제공합니다. 초과산화물라디칼은 미토콘드리아로부터 생성되어 과산화수소로 전환됩니다. 카탈라아제 및 총 글루타치온 함량의 강화에도 불구하고, 세포 내 산화적 손상은 세포내 구성 물질을 파괴하였습니다. Periplanetasin-4는 과산화물 라디칼 생성, 미토콘드리아에서의 칼슘 흡수 및 증가 된 투과성 및 알칼리화와 같은 액포의 기능손실과 관련된 세포 사멸을 유도 하였습니다. 액포에서 미토콘드리아로의 칼슘 이동이 발생하는 동안, 이들 소기관과의 혼선이 진행되어 고유 기능이 손상되었습니다. 요약하면, periplanetasin-4는 미토콘드리아 기능을 약화시키면서 과산화물 신호를 자극하고 액포와의 상호작용을 방해합니다. 이어서, 또다른 병원성 미생물인 Escherichia coli를 대상으로 하여 항균 활성과 세포내 작용기전을 산화 질소 역할 관점에서 관찰하였습니다. 산화 질소 (Nitric oxide, NO)의 역할과 중요성은 이미 보고되었습니다. 많은 미생물의 경우, 외인성 NO에 노출되면 독성이 높아 결국 세포 사멸로 이어집니다. 이 연구에서, periplanetasin-4는 내인성 NO의 역할을 확인하는 데 사용됩니다. Periplanetasin-4는 과산화물 음이온 수준을 높입니다. 과산화물과 산화질소간의 상호 작용로 생긴 과산화 질산염은 심각한 세포 내 손상을 유발합니다. 또한, 대장균에서 periplanetasin-4의 역할은 칼슘 의존성 NO 신호를 유발하는 것입니다. NO 합성이 중단 될 때 NO 신호에 의해 야기 된 세포 내 손상이 감소됨을 확인함으로써, NO가 세포 내 성분의 산화 적 손상에 참여하는 것으로 입증되었습니다. 세포 내 물질에 대한 손상이 선택적으로 발생하였고 DNA 수선 단백질도 관련되었습니다. 전형적인 SOS 수선 단백질 인 RecA 및 LexA 단백질의 발현 수준이 상당히 변화되었습니다. dinF의 유전자가 결손이 되었을 때 periplanetasin-4는 과산화물 및 NO의 축적으로 인한 세포 내 물질의 손상을 유발하지 않았습니다. 결론적으로, periplanetasin-4는 박테리아에서 칼슘 의존적 NO 신호를 자극하고 그 신호는 dinF 유전자와 관련이 있습니다. 마지막으로, 정전기 상호 작용 및 소수성 상호 작용에 기초한 periplanetasin-4의 효과를 탐구하기 위해, 알짜 전하의 증가 및 소수성의 감소를 목적으로 아르기닌 잔기를 치환함으로써 유사체를 설계 하였습니다. 그 유사체는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대해 periplanetasin-4보다 낮은 감수성을 나타냈습니다. Periplanetasin-4와 마찬가지로, 유사체는 인간 적혈구에 대한 용혈 활성을 거의 나타내지 않았습니다. 세포막막 연구를 통해 유사체가 periplanetasin-4와 같은 세포막 기능을 방해하지 않는 것으로 밝혀졌습니다. 마찬가지로, 모든 유사체는 인공 세포막 모델에 작은 사이즈의 물질을 통과시킬 수 없었습니다. 요약하면, 아르기닌으로의 치환은 Periplanetasin-4의 막 파괴 능력을 유지할 수 없었습니다. 세포막과의 소수성 상호 작용의 감소는 정전기적 상호 작용을 형성하기 전에 막에 유사체의 축적을 감소시킨다고 생각했습니다. 종합하면, 본 연구는 곤충으로부터의 항균성 펩타이드의 개발을 장려하고 이들의 막-표적 메카니즘에 대한 이해를 향상시킵니다. 아르기닌으로의 치환은 periplanetasin-4의 고유의 막 파괴 능력을 유지할 수 없었습니다. 그리고 진균에서는 세포내 소기관과의 상호작용을 방해하며 세포사멸기작을 유도합니다. 세균에서는 산화질소와 과산화물의 반응체인 과산화 질산염이 세포내 손상을 유발하고 진핵세포와 유사한 세포사멸기작을 유도합니다. 본 연구는 곤충으로부터의 항균성 펩타이드의 개발을 장려하고 이들의 막-표적 메카니즘에 대한 이해를 향상시킬수 있습니다.
(초 록) 유해 곤충 중 하나인 바퀴벌레는 많은 종들이 인간과 밀접하게 접촉하여 생활하고 있습니다. 비위생적인 생활 방식으로 인해 유해 물질을 인간에게 옮길 수 있습니다. Periplanetasin-4 (LRHKVYGYCVLGP-NH2)는 미국 바퀴벌레인 Periplaneta americana에서 유래한 13-mer 펩타이드입니다. 인간 적혈구에 대한 항균 및 세포 독성 효과를 평가하기 위해, 미생물의 최소 저해농도, 용혈 활성 및 wjwtks 탈수소 효소 (lactate dehydrogenase, LDH) 방출 분석을 수행하였습니다. Periplanetasin-4는 헤모글로빈 및 LDH의 방출을 유도하지 않고 광범위한 항균 활성을 나타냈다. 대표적인 병원성 진균인 Candida albicans를 대상으로 하여 세포내 작용기전을 조사하였습니다. Periplanetasin-4는 막 투과성 및 탈분극의 증가와 막 역학의 변화를 통해 세포막을 파괴하여 2.3 nm의 크기의 세포 내 내용물을 통과시킬 수 있습니다. 또한, periplanetasin-4에 노출 된 세포는 반응성 산소 종 (reactive oxygen species, ROS) 및 산화된 불포화 지방산을 축적시켰다. 곰팡이 세포에서, 다양한 소기관-소기관 간의 상호작용은 세포 생존에 필수적인 역할을 합니다. 미토콘드리아와 액포 사이의 상호작용은 세포 내 신호 전달 혹은 생존에 중요한 역할을 합니다. 이 연구에서, 세포 사멸 특징인 막 손상 및 무의미한 DNA 단편화와의 자가사멸기작 활성화를 확인하였습니다. 직접적인 DNA 손상이 없는 세포 자멸 적 특징은 periplanetasin-4가 DNA와 직접 상호 작용하지 않았으며 미토콘드리아 및 액포의 기능 장애를 나타냈다는 증거를 제공합니다. 초과산화물 라디칼은 미토콘드리아로부터 생성되어 과산화수소로 전환됩니다. 카탈라아제 및 총 글루타치온 함량의 강화에도 불구하고, 세포 내 산화적 손상은 세포내 구성 물질을 파괴하였습니다. Periplanetasin-4는 과산화물 라디칼 생성, 미토콘드리아에서의 칼슘 흡수 및 증가 된 투과성 및 알칼리화와 같은 액포의 기능손실과 관련된 세포 사멸을 유도 하였습니다. 액포에서 미토콘드리아로의 칼슘 이동이 발생하는 동안, 이들 소기관과의 혼선이 진행되어 고유 기능이 손상되었습니다. 요약하면, periplanetasin-4는 미토콘드리아 기능을 약화시키면서 과산화물 신호를 자극하고 액포와의 상호작용을 방해합니다. 이어서, 또다른 병원성 미생물인 Escherichia coli를 대상으로 하여 항균 활성과 세포내 작용기전을 산화 질소 역할 관점에서 관찰하였습니다. 산화 질소 (Nitric oxide, NO)의 역할과 중요성은 이미 보고되었습니다. 많은 미생물의 경우, 외인성 NO에 노출되면 독성이 높아 결국 세포 사멸로 이어집니다. 이 연구에서, periplanetasin-4는 내인성 NO의 역할을 확인하는 데 사용됩니다. Periplanetasin-4는 과산화물 음이온 수준을 높입니다. 과산화물과 산화질소간의 상호 작용로 생긴 과산화 질산염은 심각한 세포 내 손상을 유발합니다. 또한, 대장균에서 periplanetasin-4의 역할은 칼슘 의존성 NO 신호를 유발하는 것입니다. NO 합성이 중단 될 때 NO 신호에 의해 야기 된 세포 내 손상이 감소됨을 확인함으로써, NO가 세포 내 성분의 산화 적 손상에 참여하는 것으로 입증되었습니다. 세포 내 물질에 대한 손상이 선택적으로 발생하였고 DNA 수선 단백질도 관련되었습니다. 전형적인 SOS 수선 단백질 인 RecA 및 LexA 단백질의 발현 수준이 상당히 변화되었습니다. dinF의 유전자가 결손이 되었을 때 periplanetasin-4는 과산화물 및 NO의 축적으로 인한 세포 내 물질의 손상을 유발하지 않았습니다. 결론적으로, periplanetasin-4는 박테리아에서 칼슘 의존적 NO 신호를 자극하고 그 신호는 dinF 유전자와 관련이 있습니다. 마지막으로, 정전기 상호 작용 및 소수성 상호 작용에 기초한 periplanetasin-4의 효과를 탐구하기 위해, 알짜 전하의 증가 및 소수성의 감소를 목적으로 아르기닌 잔기를 치환함으로써 유사체를 설계 하였습니다. 그 유사체는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대해 periplanetasin-4보다 낮은 감수성을 나타냈습니다. Periplanetasin-4와 마찬가지로, 유사체는 인간 적혈구에 대한 용혈 활성을 거의 나타내지 않았습니다. 세포막막 연구를 통해 유사체가 periplanetasin-4와 같은 세포막 기능을 방해하지 않는 것으로 밝혀졌습니다. 마찬가지로, 모든 유사체는 인공 세포막 모델에 작은 사이즈의 물질을 통과시킬 수 없었습니다. 요약하면, 아르기닌으로의 치환은 Periplanetasin-4의 막 파괴 능력을 유지할 수 없었습니다. 세포막과의 소수성 상호 작용의 감소는 정전기적 상호 작용을 형성하기 전에 막에 유사체의 축적을 감소시킨다고 생각했습니다. 종합하면, 본 연구는 곤충으로부터의 항균성 펩타이드의 개발을 장려하고 이들의 막-표적 메카니즘에 대한 이해를 향상시킵니다. 아르기닌으로의 치환은 periplanetasin-4의 고유의 막 파괴 능력을 유지할 수 없었습니다. 그리고 진균에서는 세포내 소기관과의 상호작용을 방해하며 세포사멸기작을 유도합니다. 세균에서는 산화질소와 과산화물의 반응체인 과산화 질산염이 세포내 손상을 유발하고 진핵세포와 유사한 세포사멸기작을 유도합니다. 본 연구는 곤충으로부터의 항균성 펩타이드의 개발을 장려하고 이들의 막-표적 메카니즘에 대한 이해를 향상시킬수 있습니다.
Cockroaches are an ancient group of insects, and many species live in close contact with humans. Owing to their unsanitary lifestyle, they can transfer harmful substances to humans. Periplanetasin-4 (LRHKVYGYCVLGP-NH2) is a 13-mer peptide derived from the American Cockroach Periplaneta americana. To...
Cockroaches are an ancient group of insects, and many species live in close contact with humans. Owing to their unsanitary lifestyle, they can transfer harmful substances to humans. Periplanetasin-4 (LRHKVYGYCVLGP-NH2) is a 13-mer peptide derived from the American Cockroach Periplaneta americana. To evaluate the antimicrobial and cytotoxic effects against human erythrocytes, microbial susceptibility, hemolysis, and lactate dehydrogenase (LDH) release assays were performed. Periplanetasin-4 exhibited broad-spectrum antimicrobial activity without inducing the release of hemoglobin and LDH. Its mode of action against representative microbial cells was investigated. Periplanetasin-4 disrupted the cell membrane via an increase of membrane permeability and depolarization and changes in membrane dynamics, allowing the passage of small intracellular contents, lower size of 2.3 nm. In addition, periplanetasin-4-exposed cells accumulated reactive oxygen species (ROS) and oxidized unsaturated fatty acids. In fungal cells, communications between various organelle-organelles play an essential role in cell survival. The cross-talk between mitochondria and vacuoles comes up with the vital roles of the intercompartmental process. In this study, we found a couple of cell death features, membrane damage, and apoptosis activation with insignificant DNA fragmentation. Apoptotic features without DNA damage provide evidence that this peptide did not interact with DNA directly and exhibited dysfunction of mitochondria and vacuoles. Superoxide radicals were generated from mitochondria and converted to hydrogen peroxide. Despite the enhancement of catalase and total glutathione contents, oxidative damage disrupted intracellular contents. Periplanetasin-4 induced cell death associated with the superoxide radical production, calcium uptake in mitochondria and disorder of vacuoles, such as increased permeability and alkalization. While calcium movement from vacuoles to the mitochondria occurs, the cross-talk with these organelles proceeded and the inherent functionality was impaired. To sum up, periplanetasin-4 stimulates superoxide signal along with undermining the mitochondrial functions and interfere in communication with vacuoles. Furthermore, the intracellular response by periplanetasin-4 was observed in bacterial cells. The role and importance of nitric oxide (NO) have already been reported. For many microorganisms, exposure to exogenous NO exhibits high toxicity and eventually leads to cell death. In this study, periplanetasin-4 is used to identify the role of endogenous NO. Periplanetasin-4 elevates the superoxide anion level. NO interaction with superoxide and its byproduct induce severe intracellular damage. The role of periplanetasin-4 in Escherichia coli is triggering calcium-dependent NO signaling. By confirming that the intracellular damage caused by the NO signal is reduced when NO synthesis is interrupted, it has been demonstrated that NO participates in the oxidative damage of intracellular components. Damage to intracellular material occurred selectively and DNA repair proteins were also involved. The expression levels of RecA and LexA proteins, which are typical SOS repair proteins, were significantly changed. In the absence of dinF periplanetasin-4 did not induce deterioration of intracellular molecules which is followed by accumulation of superoxide and NO. In conclusion, periplanetasin-4 stimulates calcium-dependent NO signaling in bacteria and its signal is highly related to the din gene. Finally, to explore the effect of perplanetasin-4 through an increase of net charge and decrease of hydrophobicity of periplanetasin-4, analogs were designed by substituting arginine residue, based on the electrostatic interaction and hydrophobic interaction. Its analogs showed low susceptibility rather than periplanetasin-4 against Gram-positive and Gram-negative bacteria. In common with periplanetasin-4, the analogs were slightly exhibited hemolysis activity against human erythrocytes. Membrane studies revealed that the analogs did not disrupt membrane integrity like periplanetasin-4. Likewise, all of the analogs could not allow the passage of small contents in model membranes. To sum up, the substitution of arginine could not maintain membrane disruption ability of peirplanetasin-4. It considered that attenuation of hydrophobic interaction with plasma membranes causes a reduction of accumulation of analogs on the membrane before forming electrostatic interaction. The finding assists the further development of direct AMPs design for the clinical use. Taken together, this study encourages the development of antimicrobial peptides from insects and improves our understanding of their membrane-targeting mechanisms. Taken together, this study encourages the development of antibacterial peptides from insects and improves their understanding of membrane-target mechanisms. The substitution of arginine was unable to maintain the inherent membrane-destructive capability. Additionally, periplanetasin-4 interferes with the intracellular micro-organism and induces apoptosis in fungal cells. In bacterial cells, peroxynitrite, a reaction of nitrogen oxide and superoxide, cause intracellular damage and induce apoptosis similar to eukaryotic cells. This study can encourage the development of antibacterial peptides from insects and improve their understanding of membrane-target mechanisms.
Cockroaches are an ancient group of insects, and many species live in close contact with humans. Owing to their unsanitary lifestyle, they can transfer harmful substances to humans. Periplanetasin-4 (LRHKVYGYCVLGP-NH2) is a 13-mer peptide derived from the American Cockroach Periplaneta americana. To evaluate the antimicrobial and cytotoxic effects against human erythrocytes, microbial susceptibility, hemolysis, and lactate dehydrogenase (LDH) release assays were performed. Periplanetasin-4 exhibited broad-spectrum antimicrobial activity without inducing the release of hemoglobin and LDH. Its mode of action against representative microbial cells was investigated. Periplanetasin-4 disrupted the cell membrane via an increase of membrane permeability and depolarization and changes in membrane dynamics, allowing the passage of small intracellular contents, lower size of 2.3 nm. In addition, periplanetasin-4-exposed cells accumulated reactive oxygen species (ROS) and oxidized unsaturated fatty acids. In fungal cells, communications between various organelle-organelles play an essential role in cell survival. The cross-talk between mitochondria and vacuoles comes up with the vital roles of the intercompartmental process. In this study, we found a couple of cell death features, membrane damage, and apoptosis activation with insignificant DNA fragmentation. Apoptotic features without DNA damage provide evidence that this peptide did not interact with DNA directly and exhibited dysfunction of mitochondria and vacuoles. Superoxide radicals were generated from mitochondria and converted to hydrogen peroxide. Despite the enhancement of catalase and total glutathione contents, oxidative damage disrupted intracellular contents. Periplanetasin-4 induced cell death associated with the superoxide radical production, calcium uptake in mitochondria and disorder of vacuoles, such as increased permeability and alkalization. While calcium movement from vacuoles to the mitochondria occurs, the cross-talk with these organelles proceeded and the inherent functionality was impaired. To sum up, periplanetasin-4 stimulates superoxide signal along with undermining the mitochondrial functions and interfere in communication with vacuoles. Furthermore, the intracellular response by periplanetasin-4 was observed in bacterial cells. The role and importance of nitric oxide (NO) have already been reported. For many microorganisms, exposure to exogenous NO exhibits high toxicity and eventually leads to cell death. In this study, periplanetasin-4 is used to identify the role of endogenous NO. Periplanetasin-4 elevates the superoxide anion level. NO interaction with superoxide and its byproduct induce severe intracellular damage. The role of periplanetasin-4 in Escherichia coli is triggering calcium-dependent NO signaling. By confirming that the intracellular damage caused by the NO signal is reduced when NO synthesis is interrupted, it has been demonstrated that NO participates in the oxidative damage of intracellular components. Damage to intracellular material occurred selectively and DNA repair proteins were also involved. The expression levels of RecA and LexA proteins, which are typical SOS repair proteins, were significantly changed. In the absence of dinF periplanetasin-4 did not induce deterioration of intracellular molecules which is followed by accumulation of superoxide and NO. In conclusion, periplanetasin-4 stimulates calcium-dependent NO signaling in bacteria and its signal is highly related to the din gene. Finally, to explore the effect of perplanetasin-4 through an increase of net charge and decrease of hydrophobicity of periplanetasin-4, analogs were designed by substituting arginine residue, based on the electrostatic interaction and hydrophobic interaction. Its analogs showed low susceptibility rather than periplanetasin-4 against Gram-positive and Gram-negative bacteria. In common with periplanetasin-4, the analogs were slightly exhibited hemolysis activity against human erythrocytes. Membrane studies revealed that the analogs did not disrupt membrane integrity like periplanetasin-4. Likewise, all of the analogs could not allow the passage of small contents in model membranes. To sum up, the substitution of arginine could not maintain membrane disruption ability of peirplanetasin-4. It considered that attenuation of hydrophobic interaction with plasma membranes causes a reduction of accumulation of analogs on the membrane before forming electrostatic interaction. The finding assists the further development of direct AMPs design for the clinical use. Taken together, this study encourages the development of antimicrobial peptides from insects and improves our understanding of their membrane-targeting mechanisms. Taken together, this study encourages the development of antibacterial peptides from insects and improves their understanding of membrane-target mechanisms. The substitution of arginine was unable to maintain the inherent membrane-destructive capability. Additionally, periplanetasin-4 interferes with the intracellular micro-organism and induces apoptosis in fungal cells. In bacterial cells, peroxynitrite, a reaction of nitrogen oxide and superoxide, cause intracellular damage and induce apoptosis similar to eukaryotic cells. This study can encourage the development of antibacterial peptides from insects and improve their understanding of membrane-target mechanisms.
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