[학위논문]CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 OXP1 유전자교정 및 Brachypodium ARGOS 유전자들의 애기장대에서의 기능 분석 CRISPR/Cas9-mediated OXP1 gene editing and functional analysis of Brachypodium ARGOS genes in Arabidopsis원문보기
잡초는 작물과 빛, 물, 영양 성분을 두고 경쟁하며 농업 생산성을 감소시키는 주요한 생물학적 위협이다. 이에 잡초를 방제하기 위한 제초제들이 널리 사용되고 있다. 그에 따라 전통 식물 육종 및 유전자 변형 기술을 이용하여 다양한 제초제 저항성 작물이 개발되어 왔으며 최근에는 CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 한 유전자교정기술이 제초제 저항성 형질 도입을 위해 이용되고 있다. 본 연구는 ...
잡초는 작물과 빛, 물, 영양 성분을 두고 경쟁하며 농업 생산성을 감소시키는 주요한 생물학적 위협이다. 이에 잡초를 방제하기 위한 제초제들이 널리 사용되고 있다. 그에 따라 전통 식물 육종 및 유전자 변형 기술을 이용하여 다양한 제초제 저항성 작물이 개발되어 왔으며 최근에는 CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 한 유전자교정기술이 제초제 저항성 형질 도입을 위해 이용되고 있다. 본 연구는 CRISPR/Cas9 매개 유전자교정기술을 5-oxoprolinase 1 (OXP1) 유전자에 적용하여 삽입 또는 결실 돌연변이를 유도함으로써 제초제 저항성 애기장대 식물체를 제작하였다. OXP1은 glutathione recycling 경로에 관여하는 효소이며, OXP1 기능 상실 식물체(oxp1)는 Smex (Sulfamethoxazole)와 같은 sulfonamide 계열 물질에 대한 반응성이 감소한 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 Smex 함유 배지에서 식물체를 선별함으로써 CRISPR/Cas9 매개 유전자교정을 이용한 OXP1 돌연변이체 (oxp1/CRISPR으로 명명) 를 제작하였고 oxp1/CRISPR 식물체의 삽입결실 돌연변이에 대한 염기서열 분석을 통해OXP1 돌연변이와 Smex 저항성 간 양의 상관관계를 확인하였다. 또한 oxp1/CRISPR 식물체는 카드뮴과 같은 중금속 저항성을 보여주었다. 따라서 본 연구는 삽입결실 돌연변이를 이용한 제초제 저항성 식물 제조 방법을 제공함과 동시에 식물의 유전자교정에 대한 선택적 마커로써의 OXP1 이용 가능성을 제시한다. 본 연구의 두 번째 주제는 숲개밀 (Brachypodium distachyon) 에서 분리한 ARGOS (Auxin Regulated Gene involved in Organ Size) 유전자의 기능 분석이다. 애기장대에는 4 개의 ARGOS 상동 유전자 (AtARGOS) 가 존재하며, 이들은 세포 증식 및 팽창에 관여하여 기관 생장을 촉진한다. AtARGOS 과발현 애기장대는 야생형 식물체 (Col-0) 에 비해 기관 크기가 크고 에틸렌에 대한 반응성이 감소되는 등 뚜렷한 표현형을 보였다. 본 연구에서는 6 종의 BdARGOS 유전자 (BdARGOS1~6) 들을 Col-0에 도입하고 형질전환 식물체의 생장 표현형 및 에틸렌 반응성을 분석하였다. 그 결과, BdARGOS1 (Bradi2g25220) 및 BdARGOS5 (Bradi4g20940) 과발현 식물체가 기관 크기가 증대하고 키가 커지는 표현형을 보였으며 BdARGOS 과발현 식물체들은 AtARGOS 과발현 식물체와 유사하게 에틸렌에 둔감한 반응성을 보였다. 종합적으로 이 결과들은 적어도 2개의 BdARGOS 유전자가 AtARGOS 와 기능적 유사성을 가지며 이 유전자들은 잠재적으로 농작물 수확량을 향상시키는 데에 이용될 수 있음을 시사한다.
잡초는 작물과 빛, 물, 영양 성분을 두고 경쟁하며 농업 생산성을 감소시키는 주요한 생물학적 위협이다. 이에 잡초를 방제하기 위한 제초제들이 널리 사용되고 있다. 그에 따라 전통 식물 육종 및 유전자 변형 기술을 이용하여 다양한 제초제 저항성 작물이 개발되어 왔으며 최근에는 CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 한 유전자교정기술이 제초제 저항성 형질 도입을 위해 이용되고 있다. 본 연구는 CRISPR/Cas9 매개 유전자교정기술을 5-oxoprolinase 1 (OXP1) 유전자에 적용하여 삽입 또는 결실 돌연변이를 유도함으로써 제초제 저항성 애기장대 식물체를 제작하였다. OXP1은 glutathione recycling 경로에 관여하는 효소이며, OXP1 기능 상실 식물체(oxp1)는 Smex (Sulfamethoxazole)와 같은 sulfonamide 계열 물질에 대한 반응성이 감소한 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 Smex 함유 배지에서 식물체를 선별함으로써 CRISPR/Cas9 매개 유전자교정을 이용한 OXP1 돌연변이체 (oxp1/CRISPR으로 명명) 를 제작하였고 oxp1/CRISPR 식물체의 삽입결실 돌연변이에 대한 염기서열 분석을 통해OXP1 돌연변이와 Smex 저항성 간 양의 상관관계를 확인하였다. 또한 oxp1/CRISPR 식물체는 카드뮴과 같은 중금속 저항성을 보여주었다. 따라서 본 연구는 삽입결실 돌연변이를 이용한 제초제 저항성 식물 제조 방법을 제공함과 동시에 식물의 유전자교정에 대한 선택적 마커로써의 OXP1 이용 가능성을 제시한다. 본 연구의 두 번째 주제는 숲개밀 (Brachypodium distachyon) 에서 분리한 ARGOS (Auxin Regulated Gene involved in Organ Size) 유전자의 기능 분석이다. 애기장대에는 4 개의 ARGOS 상동 유전자 (AtARGOS) 가 존재하며, 이들은 세포 증식 및 팽창에 관여하여 기관 생장을 촉진한다. AtARGOS 과발현 애기장대는 야생형 식물체 (Col-0) 에 비해 기관 크기가 크고 에틸렌에 대한 반응성이 감소되는 등 뚜렷한 표현형을 보였다. 본 연구에서는 6 종의 BdARGOS 유전자 (BdARGOS1~6) 들을 Col-0에 도입하고 형질전환 식물체의 생장 표현형 및 에틸렌 반응성을 분석하였다. 그 결과, BdARGOS1 (Bradi2g25220) 및 BdARGOS5 (Bradi4g20940) 과발현 식물체가 기관 크기가 증대하고 키가 커지는 표현형을 보였으며 BdARGOS 과발현 식물체들은 AtARGOS 과발현 식물체와 유사하게 에틸렌에 둔감한 반응성을 보였다. 종합적으로 이 결과들은 적어도 2개의 BdARGOS 유전자가 AtARGOS 와 기능적 유사성을 가지며 이 유전자들은 잠재적으로 농작물 수확량을 향상시키는 데에 이용될 수 있음을 시사한다.
Weeds are one of the major biotic threats for the reduction of agricultural productivity as they are competing with crops for light, water, and nutritional resources. As a result, herbicides are widely used in agronomic crops as weed prevention. So far, various herbicide-resistant crops have been de...
Weeds are one of the major biotic threats for the reduction of agricultural productivity as they are competing with crops for light, water, and nutritional resources. As a result, herbicides are widely used in agronomic crops as weed prevention. So far, various herbicide-resistant crops have been developed by traditional plant breeding and GM technologies. More recently, CRISPR/Cas based gene-editing methods are used to develop crops with herbicide resistance. In this study, the herbicide-resistant Arabidopsis thaliana plant is generated by causing insertion or deletion (indel) mutations using the CRISPR/Cas9 mediated gene-editing with 5-oxoprolinase 1 (OXP1) gene as a target gene. OXP1 is an enzyme that is involved in the glutathione recycling pathway and the loss-of-function mutant (oxp1) has shown reduced sensitivity to sulfamethoxazole (Smex), a sulfonamide compound. The present study generated indel mutants of OXP1 using CRISPR/Cas9-mediated gene-editing by screening the plants on Smex-containing media (labeled as oxp1/CRISPR). Sequencing analysis of indel mutations in the oxp1/CRISPR plants showed a positive correlation between OXP1 mutation and Smex resistance. Furthermore, the oxp1/CRISPR plants exhibited tolerance to heavy metals such as cadmium. Therefore, the present study provides a way to generate the herbicide-resistant plant by the indel mutation, also suggesting a possible use of OXP1 as a marker during the gene-editing in plants. The second topic of this study is functional analyses of ARGOS (Auxin Regulated Gene involved in Organ Size) genes isolated from Brachypodium distachyon (named BdARGOS). In A. thaliana, there are four ARGOS homologous genes (AtARGOS), and the ARGOS genes involve in cell proliferation and expansion, promoting the growth of organs. Transgenic plants overexpressing AtARGOS displayed distinct phenotypes, such as increased organ sizes and reduced ethylene response, compared to wild-type plant (Col-0). In this study, six BdARGOS genes (BdARGOS1 to BdARGOS6) were introduced into Col-0, and growth phenotypes and ethylene responses of the transgenic plants were analyzed. Results showed that transgenic plants overexpressing BdARGOS1 (Bradi2g25220) and BdARGOS5 (Bradi4g20940) exhibited enlarged organs and tall phenotypes. In addition, the transgenic plants showed a reduced sensitivity to ethylene, which is similar to the plant overexpressing AtARGOS. Overall, the present results suggest that at least two BdARGOS genes have a functional similarity to AtARGOS, and propose that these genes can be potentially used to increase agronomic crop yields.
Weeds are one of the major biotic threats for the reduction of agricultural productivity as they are competing with crops for light, water, and nutritional resources. As a result, herbicides are widely used in agronomic crops as weed prevention. So far, various herbicide-resistant crops have been developed by traditional plant breeding and GM technologies. More recently, CRISPR/Cas based gene-editing methods are used to develop crops with herbicide resistance. In this study, the herbicide-resistant Arabidopsis thaliana plant is generated by causing insertion or deletion (indel) mutations using the CRISPR/Cas9 mediated gene-editing with 5-oxoprolinase 1 (OXP1) gene as a target gene. OXP1 is an enzyme that is involved in the glutathione recycling pathway and the loss-of-function mutant (oxp1) has shown reduced sensitivity to sulfamethoxazole (Smex), a sulfonamide compound. The present study generated indel mutants of OXP1 using CRISPR/Cas9-mediated gene-editing by screening the plants on Smex-containing media (labeled as oxp1/CRISPR). Sequencing analysis of indel mutations in the oxp1/CRISPR plants showed a positive correlation between OXP1 mutation and Smex resistance. Furthermore, the oxp1/CRISPR plants exhibited tolerance to heavy metals such as cadmium. Therefore, the present study provides a way to generate the herbicide-resistant plant by the indel mutation, also suggesting a possible use of OXP1 as a marker during the gene-editing in plants. The second topic of this study is functional analyses of ARGOS (Auxin Regulated Gene involved in Organ Size) genes isolated from Brachypodium distachyon (named BdARGOS). In A. thaliana, there are four ARGOS homologous genes (AtARGOS), and the ARGOS genes involve in cell proliferation and expansion, promoting the growth of organs. Transgenic plants overexpressing AtARGOS displayed distinct phenotypes, such as increased organ sizes and reduced ethylene response, compared to wild-type plant (Col-0). In this study, six BdARGOS genes (BdARGOS1 to BdARGOS6) were introduced into Col-0, and growth phenotypes and ethylene responses of the transgenic plants were analyzed. Results showed that transgenic plants overexpressing BdARGOS1 (Bradi2g25220) and BdARGOS5 (Bradi4g20940) exhibited enlarged organs and tall phenotypes. In addition, the transgenic plants showed a reduced sensitivity to ethylene, which is similar to the plant overexpressing AtARGOS. Overall, the present results suggest that at least two BdARGOS genes have a functional similarity to AtARGOS, and propose that these genes can be potentially used to increase agronomic crop yields.
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