초록 ▼

용어보기논문에서 용어와 풀이말을 자동 추출한 결과로, 시범 서비스 중입니다. AI-Helper

이질바퀴는 인간의 다양한 질병을 일으키는 미생물의 대리 숙주다. 연구에 따르면 이질바퀴는 인간에게 유해한 곤충이지만 최근 알레르겐과 같은 잠재적으로 유익하고 의학적으로 유용한 물질을 지니고 있는 것으로 확인되었다. 따라서 나는 이질바퀴로부터 생리활성 물질을 찾아내기 위해 NGS (Next generation sequencing)를 활용하여 이질바퀴의 RNA 정보를 확인하고 ...

이질바퀴는 인간의 다양한 질병을 일으키는 미생물의 대리 숙주다. 연구에 따르면 이질바퀴는 인간에게 유해한 곤충이지만 최근 알레르겐과 같은 잠재적으로 유익하고 의학적으로 유용한 물질을 지니고 있는 것으로 확인되었다. 따라서 나는 이질바퀴로부터 생리활성 물질을 찾아내기 위해 NGS (Next generation sequencing)를 활용하여 이질바퀴의 RNA 정보를 확인하고 생물정보학을 통해 생리활성 펩타이드를 확인하였다. 우선 대장균 접종을 하여 면역화시킨 것과 그렇지 않은 두 부류의 이질바퀴로부터 드노브 전사체 분석을 수행했고. Illumina HiSeq 시퀀서를 사용하여 총 9.5Gb의 시퀀스를 생성하였다. 이 시퀀스를 바탕으로 BLAST, Gene Ontology (GO) 등의 프로그램을 활용하여 85,984개의 조각으로 조립하고 그 기능을 확인하였다. 또한 인실리코 항균 펩타이드 예측 알고리즘을 제작, 활용하여 86개의 항균 펩타이드 후보물질들을 발견하였으며, 항균펩타이드 활성부위를 예측할 수 있는 AMPA 프로그램을 통해 최종 21개의 펩타이드를 선발하였다. 21개의 펩타이드로부터 곰팡이 균과 그람 양성 및 음성의 박테리아에 대한 항균 활성을 검증하였다. 그 중에 특히 11개의 펩타이드들은 이러한 유기체에 대해 강력한 항균 활동을 보였으며 적혈구 용혈 독성을 보이지 않거나 미미하였다.
이질바퀴에서 선별한 11개의 항균 펩타이드 중 항균 활성도가 가장 높은 펩타이드를 페리플라네타신-5라 명명하고 항염증, 항암 활성 효과 및 메커니즘을 검증했다. 먼저 마우스 대식세포인 Raw264.7 세포에서 페리플라네타신-5의 항염증 활동을 확인했다. 60 µg/mL의 농도까지 페리플라네타신-5를 처리 했을 때 세포독성이 관찰되지 않았으며 세포 내 산화질소(Nitric oxide)의 유리량을 감소시켰다. 또한 정량적 RT-PCR과 ELISA 분석 결과 페리플라네타신-5는 Raw264.7 세포에서 iNOS, COX-2의 단백질 및 유전자 발현을 감소시켰으며 염증성 사이토카인으로 알려진 TNF-α (Tumor necrosis factor-α)와 IL-6 (Interlukin-6)의 유전자 발현량, 유리량을 감소시켰다. 페리플라네타신-5는 염증 신호 전달 요소인 MAPKs(ERK, JNK, P38)의 인산화를 억제하고 Iκ-B의 분해를 감소시켜 염증을 저해하였다. LAL 분석을 통해 LPS의 독성 여부를 확인하였는데 페리플라네타신-5의 농도 의존적으로 LPS의 독성이 중화되는 것이 확인되었다. 이는 페리플라네타신-5가 최초 LPS에 작용하여 염증반응을 억제한다고 유추할 수 있다. 따라서 언급된 데이터들은 페리플라네타신-5가 LPS로부터 유발되는 염증을 제어하는데 효과가 있음을 보여준다.
두 번째로 페리플라네타신-5의 인간 혈액암 세포에 대한 항암 효과를 조사했다. 페리플라네타신-5는 인간 백혈병을 유발하는 세포인 K562의 세포 생존률을 농도의존적으로 감소시켰으며 LDH 유출 실험을 통해 암세포에 대한 독성을 재검증하였다. Annexin V/Propidium Iodide Staining, Acridine orange/Ethidium bromide staining, DNA fragmentation 실험을 통해 페리플라네타신-5가 백혈병 세포의 세포 사멸 및 괴사를 유도하는 것을 확인했다. 그리고 세포질 단백질인 Fas, cytochrom c의 발현 증가와 미토콘드리아 단백질인 Bcl-2의 발현 감소에 영향을 주었으며 pro-caspase-9, pro-caspase-8, pro-caspase-3, poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 중합효소의 절단을 유도했다. 위의 데이터를 통해 페리플라네타신-5로 인한 세포 사멸이 진행될 때 외인성 경로와 내인성 경로 모두에 의해 유도된다는 것을 확인했으며 카스파제 억제제인 Z-VAD-FMK의 처리로 페리플라네타신-5로부터 유도된 K562 세포의 생존성 감소를 역전시켜 세포 사멸시 카스파제와의 연관성을 재확인했다. 이 연구들은 이질바퀴로부터 새로운 항균 펩타이드의 선별과 개발을 위한 기초 데이터를 제공하며 이질바퀴에서 유래한 펩타이드인 페리플라네타신-5의 항균, 항염증 및 항암 효과를 검증 함으로써 추후 잠재적 의약 소재로의 가능성을 확인했다.

Abstract ▼ AI-Helper

Cockroaches are surrogate hosts for microbes that cause many human diseases. In spite of their generally destructive nature, cockroaches have recently been found to harbor potentially beneficial and medically useful substances such as drugs and allergens. However, genomic information for the America...

Cockroaches are surrogate hosts for microbes that cause many human diseases. In spite of their generally destructive nature, cockroaches have recently been found to harbor potentially beneficial and medically useful substances such as drugs and allergens. However, genomic information for the American cockroach (Periplaneta americana) is currently unavailable. therefore, I performed de novo transcriptome analysis of P. americana that were or were not immunized with Escherichia coli. Using an Illumina HiSeq sequencer, I generated a total of 9.5 Gb of sequences, which were assembled into 85,984 contigs and functionally annotated using Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), Gene Ontology (GO), and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) database terms. Finally, using an in silico antimicrobial peptide prediction method, 86 antimicrobial peptide candidates were predicted from the transcriptome, and 21 of these peptides were experimentally validated for their antimicrobial activity against yeast and gram positive and -negative bacteria by a radial diffusion assay. Notably, 11 peptides showed strong antimicrobial activities against these organisms and displayed little or no cytotoxic effects in the hemolysis and cell viability assay. I checked the anti-inflammatory, anti-cancer activity effect on periplanetasin-5 which had the highest antibacterial activity among the 11 AMPs selected from cockroaches and verified its mechanism. First, I demonstrated the anti-inflammatory activities of periplanetasin-5 in mouse macrophage Raw264.7 cells. No cytotoxicity was observed at 60 µg/mL periplanetasin-5, and treatment decreased nitric oxide production in Raw264.7 cells exposed to lipopolysaccharide (LPS). In addition, quantitative RT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay revealed that periplanetasin-5 reduced cytokine (tumor necrosis factor-α, interleukin-6) expression levels in the Raw264.7 cells. Periplanetasin-5 controlled inflammation by inhibiting phosphorylation of MAPKs, an inflammatory signaling element, and reducing the degradation of IκB. Through LAL assay, LPS toxicity was found to decrease in a periplanetasin-5 dose-dependent manner. Collectively, These data showed that periplanetasin-5 had anti-inflammatory activities, exemplified in LPS-exposed Raw264.7 cells. Second, I investigated whether periplanetasin-5 has anticancer activity against the human leukemia cell line K562. Periplanetasin-5 demonstrated cytotoxic effects and decreased the cell viability of K562 cells. I found that periplanetasin-5 induced apoptotic and necrotic cell death in leukemia cells using flow cytometric analysis, acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) staining, and DNA fragmentation. In addition, these events were associated with increased levels of the proapoptotic proteins Fas and cytochrome c and reduced levels of the anti-apoptotic protein Bcl-2. Periplanetasin-5 induces the cleavage of pro-caspase-9, pro-caspase-8, pro-caspase-3, and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). The above data suggest that periplanetasin-5 induces apoptosis via both the intrinsic and extrinsic pathways. Furthermore, caspase-related apoptosis was further confirmed by using the caspase inhibitor (Z-VAD-FMK), which reversed the periplanetasin-5-induced reduction in cell viability. The study provides basic data for screening new antibacterial peptide, and suggests the possibility as a medicinal material in the future by providing the anti-cancer and anti-inflammatory efficacy of candidates for potentially useful antimicrobial peptide derived from Periplaneta americana.

Keyword