각질형성세포에서 DNCB,LPS로 유도된 아토피 피부염에 대한 한약재 및 추출물의 염증 억제 효과 및 기전 연구 Anti-inflammatory effect of herbal extracts against DNCB and LPS-induced atopic dermatitis through TLR4 signaling in keratinocytes원문보기
아토피 피부염은 만성적인 피부 염증 질환으로 가려움증, 발적, 수면방해, 태선화 등 정신적, 신체적으로 큰 스트레스로 작용한다. 아토피 피부염의 원인은 정확히 밝혀지지 않은 실정이다. 소아기에 약 15~20%의 높은 발병율을 보이며 성인은 1~3%으로 전세계적으로 8~30% 정도의 유병율을 보이며 점점 증가하고 있다. 환자 및 가족의 삶의 질에 부정적인 영향을 끼치는 것으로 밝혀졌으며 직간접적인 의료 비용 또한 상당한 비중을 차지한다. 아토피 피부염은 극도의 스트레스, ...
아토피 피부염은 만성적인 피부 염증 질환으로 가려움증, 발적, 수면방해, 태선화 등 정신적, 신체적으로 큰 스트레스로 작용한다. 아토피 피부염의 원인은 정확히 밝혀지지 않은 실정이다. 소아기에 약 15~20%의 높은 발병율을 보이며 성인은 1~3%으로 전세계적으로 8~30% 정도의 유병율을 보이며 점점 증가하고 있다. 환자 및 가족의 삶의 질에 부정적인 영향을 끼치는 것으로 밝혀졌으며 직간접적인 의료 비용 또한 상당한 비중을 차지한다. 아토피 피부염은 극도의 스트레스, 식품 알레르기, 피부자극, 면역기능의 이상 및 유전적인 요인 이상으로 발병하는 질환이므로 시발물질이 되는 항원 차단 및 회피가 중요하다. 아토피 피부염의 치료제로는 경구용 항히스타민제, H2 길항제, 국소용 스테로이드, 타르요법, 면역조절제 등이 있다. 하지만, 상당수 치료제들은 부작용과 치료 중지 후 재발률이 높은 것으로 알려져 있다. 사용에 각별한 주의가 필요하고 의사의 지시에 따라야 한다. 이러한 문제점으로 인해 부작용은 적고 염증 억제 효과가 있는 한약재 및 추출물의 연구가 필요하다고 사료된다. 전염증성 사이토카인 분비에 연관되어 있는 TLR4 signaling은 세포막 단백질로 LPS, 염증성 사이토카인 등으로 인해 활성화되면 세포내 신호 전달경로인 NF-kB 활성화와 이하 신호전달의 활성화가 염증성 사이토카인 생성으로 이어지며 면역체계를 활성화시킨다. 본 연구는 인간 피부 각질 세포주인 HaCaT cell을 이용하여 각 한약재와 추출물들의 세포생존율, Total phenol, Total flavonoide, qRT-PCR, ELISA, western blots 등의 실험을 통해 염증 억제 효과가 있는지 탐색하였다. 그 후 염증과 관련 있는 TLR4 signaling의 신호전달물질 inhibitor을 처리하여 어떤 신호전달 단백질의 억제를 보이는지 알아보기 위하여 연구를 수행하였다. 세포생존율 측정 결과 DNCB처리 실험에서는 만형자, 갈화E, 블랙커런트가 높은 생존율을 보였고 LPS처리 실험에서는 만형자E, 목단피, 복분자가 높은 생존율을 보였다. 각 한약재와 추출물들은 농도 의존적으로 생존율이 증가했으며 추가로 염증 유도물질을 제외한 농도별 세포생존율을 측정하여 농도별로 독성을 나타는 지와 이후 실험 농도를 선택하였다. 50ug/ml이상에서 세포생존율이 떨어지는 compound가 있어 이후 실험은 20ug/ml과 50ug/ml으로 진행하였다. 총 플라보노이드 실험에서 복분자>만형자E>갈화E>목단피>블랙커런트 순으로 총 페놀 실험에서 목단피>갈화E>만형자E>복분자>블랙커런트 순으로 높은 함량을 나타냈다. 염증 억제 효과를 알아보기 위해 염증을 일으키는 사이토카인의 qRT-PCR을 진행하였다. DNCB처리 실험과 LPS실험 전체적으로 각 compound들이 염증성 사이토카인의 발현량을 유의적으로 감소시켰고 특히 DNCB는 만형자, 갈화E가 LPS는 목단피가 감소량이 대폭컸다. 세포외로 분비되는 IL-6의 분비량을 알아보기 위해 진행한 ELISA실험에서도 농도 의존적으로 DNCB처리(만형자=갈화E>블랙커런트) 실험과 LPS처리(목단피>만형자E>복분자)실험 모두 감 소하였다. 감소폭은 만형자, 갈화E, 목단피가 가장 컸다. 각 compound들의 염증지표 감소가 염증 관련 신호전달인 TRL4 signaling 중 어떤 단백질의 억제로 인한 것인지 알아보기 위해 TRL4, IKK-α, JNK의 mRNA 발현량과 각 단백질의 inhibitor 처리 후 mRNA 발현량을 비교하였다. 이로써 DNCB 처리실험에서는 만형자, 갈화E가 LPS 처리실험에서는 목단피가 IKK-α의 발현량을 억제시키는 것으로 사료된다. IKK-α의 발현량 억제 시켜 염증성 사이토카인의 발현량을 감소시키고 염증억제 효과를 보이는 것으로 사료된다.’ IKK-α의 발현량과 실제로 합성되는 IKK 단백질의 양을 비교하기 위해 western blots을 진행하였다. DNCB 처리한 실험에서 만형자, 갈화E가 유의적으로 단백질양이 Control 대비 감소하였으며 P-IKK 또한 만형자와 갈화E가 control 대비 감소하였다. LPS 처리한 실험에서 만형자E, 목단피, 블랙커런트 모두 유의적으로 단백질양이 control 대비 감소하였으며 P-IKK 또한 만형자E, 목단피, 블랙커런트 모두 유의적, 농도의존적으로 control 대비 단백질양이 감소하였다. 결론적으로 DNCB 처리시 만형자, 갈화E가 IKK-α의 억제를 통해 염증 억제효과를 나타내는 것으로 사료된다. LPS 처리시 만형자E, 목단피. 복분자가 IKK-α의 억제를 통해 염증 억제효과를 나타내는 것으로 사료된다.
아토피 피부염은 만성적인 피부 염증 질환으로 가려움증, 발적, 수면방해, 태선화 등 정신적, 신체적으로 큰 스트레스로 작용한다. 아토피 피부염의 원인은 정확히 밝혀지지 않은 실정이다. 소아기에 약 15~20%의 높은 발병율을 보이며 성인은 1~3%으로 전세계적으로 8~30% 정도의 유병율을 보이며 점점 증가하고 있다. 환자 및 가족의 삶의 질에 부정적인 영향을 끼치는 것으로 밝혀졌으며 직간접적인 의료 비용 또한 상당한 비중을 차지한다. 아토피 피부염은 극도의 스트레스, 식품 알레르기, 피부자극, 면역기능의 이상 및 유전적인 요인 이상으로 발병하는 질환이므로 시발물질이 되는 항원 차단 및 회피가 중요하다. 아토피 피부염의 치료제로는 경구용 항히스타민제, H2 길항제, 국소용 스테로이드, 타르요법, 면역조절제 등이 있다. 하지만, 상당수 치료제들은 부작용과 치료 중지 후 재발률이 높은 것으로 알려져 있다. 사용에 각별한 주의가 필요하고 의사의 지시에 따라야 한다. 이러한 문제점으로 인해 부작용은 적고 염증 억제 효과가 있는 한약재 및 추출물의 연구가 필요하다고 사료된다. 전염증성 사이토카인 분비에 연관되어 있는 TLR4 signaling은 세포막 단백질로 LPS, 염증성 사이토카인 등으로 인해 활성화되면 세포내 신호 전달경로인 NF-kB 활성화와 이하 신호전달의 활성화가 염증성 사이토카인 생성으로 이어지며 면역체계를 활성화시킨다. 본 연구는 인간 피부 각질 세포주인 HaCaT cell을 이용하여 각 한약재와 추출물들의 세포생존율, Total phenol, Total flavonoide, qRT-PCR, ELISA, western blots 등의 실험을 통해 염증 억제 효과가 있는지 탐색하였다. 그 후 염증과 관련 있는 TLR4 signaling의 신호전달물질 inhibitor을 처리하여 어떤 신호전달 단백질의 억제를 보이는지 알아보기 위하여 연구를 수행하였다. 세포생존율 측정 결과 DNCB처리 실험에서는 만형자, 갈화E, 블랙커런트가 높은 생존율을 보였고 LPS처리 실험에서는 만형자E, 목단피, 복분자가 높은 생존율을 보였다. 각 한약재와 추출물들은 농도 의존적으로 생존율이 증가했으며 추가로 염증 유도물질을 제외한 농도별 세포생존율을 측정하여 농도별로 독성을 나타는 지와 이후 실험 농도를 선택하였다. 50ug/ml이상에서 세포생존율이 떨어지는 compound가 있어 이후 실험은 20ug/ml과 50ug/ml으로 진행하였다. 총 플라보노이드 실험에서 복분자>만형자E>갈화E>목단피>블랙커런트 순으로 총 페놀 실험에서 목단피>갈화E>만형자E>복분자>블랙커런트 순으로 높은 함량을 나타냈다. 염증 억제 효과를 알아보기 위해 염증을 일으키는 사이토카인의 qRT-PCR을 진행하였다. DNCB처리 실험과 LPS실험 전체적으로 각 compound들이 염증성 사이토카인의 발현량을 유의적으로 감소시켰고 특히 DNCB는 만형자, 갈화E가 LPS는 목단피가 감소량이 대폭컸다. 세포외로 분비되는 IL-6의 분비량을 알아보기 위해 진행한 ELISA실험에서도 농도 의존적으로 DNCB처리(만형자=갈화E>블랙커런트) 실험과 LPS처리(목단피>만형자E>복분자)실험 모두 감 소하였다. 감소폭은 만형자, 갈화E, 목단피가 가장 컸다. 각 compound들의 염증지표 감소가 염증 관련 신호전달인 TRL4 signaling 중 어떤 단백질의 억제로 인한 것인지 알아보기 위해 TRL4, IKK-α, JNK의 mRNA 발현량과 각 단백질의 inhibitor 처리 후 mRNA 발현량을 비교하였다. 이로써 DNCB 처리실험에서는 만형자, 갈화E가 LPS 처리실험에서는 목단피가 IKK-α의 발현량을 억제시키는 것으로 사료된다. IKK-α의 발현량 억제 시켜 염증성 사이토카인의 발현량을 감소시키고 염증억제 효과를 보이는 것으로 사료된다.’ IKK-α의 발현량과 실제로 합성되는 IKK 단백질의 양을 비교하기 위해 western blots을 진행하였다. DNCB 처리한 실험에서 만형자, 갈화E가 유의적으로 단백질양이 Control 대비 감소하였으며 P-IKK 또한 만형자와 갈화E가 control 대비 감소하였다. LPS 처리한 실험에서 만형자E, 목단피, 블랙커런트 모두 유의적으로 단백질양이 control 대비 감소하였으며 P-IKK 또한 만형자E, 목단피, 블랙커런트 모두 유의적, 농도의존적으로 control 대비 단백질양이 감소하였다. 결론적으로 DNCB 처리시 만형자, 갈화E가 IKK-α의 억제를 통해 염증 억제효과를 나타내는 것으로 사료된다. LPS 처리시 만형자E, 목단피. 복분자가 IKK-α의 억제를 통해 염증 억제효과를 나타내는 것으로 사료된다.
Atopic dermatitis is a chronic skin inflammatory disease that acts as a mental and physical stress such as itching, redness, obstruction of sleep, and taseonization. The cause of atopic dermatitis has yet to be determined. It has a high incidence rate of about 15-20% in childhood, with 1-3% in adult...
Atopic dermatitis is a chronic skin inflammatory disease that acts as a mental and physical stress such as itching, redness, obstruction of sleep, and taseonization. The cause of atopic dermatitis has yet to be determined. It has a high incidence rate of about 15-20% in childhood, with 1-3% in adults, and an increasing prevalence rate of 8 to 30% worldwide. It has been found to have a negative impact on the quality of life for patients and families, and direct and indirect medical costs also account for a significant portion. Atopic dermatitis is a disease that develops beyond extreme stress, food allergies, skin irritation, abnormalities in immune function, and genetic factors, so it is important to block and avoid antigen that becomes a starting substance. Treatments for atopic dermatitis include oral antihistamine, H2 antagonists, local steroids, tar therapy, and immunosuppressants. However, many treatments are known to have high rates of side effects and recurrence after treatment is stopped. Special attention should be paid to use and follow the doctor's instructions. Due to these problems, studies of herbal medicines and extracts with low side effects and inflammatory inhibition are required. TLR4 signaling, associated with the secretion of infectious cytokines, is a membrane protein that, when activated due to LPS, inflammatory cytokines, leads to the activation of the intracellular signaling pathway NF-kB and the activation of the signaling below, leading to inflammatory cytokines production of the immune system. In this study, HaCaT cell, a human skin keratin cell owner, was used to investigate the cell survival rate of each herbal drug and extract, Total phenol, Total flavonoid, qRT-PCR, ELISA, and western blots for inflammatory inhibition. The study was then conducted to investigate the inhibition of the signaling protein by processing the signal transporter in TLR4 signaling associated with inflammation. As a result of cell survival measurements, Vitex rotundifolia L. E, and blackcurrant showed high survival rates in the DNCB induction experiment, and in the LPS induction experiment, Vitex rotundifolia L. E, Pueraria lobata flower (ethanol extract), and bimolecules showed high survival rates. Each herbal medicine and extract increased their survival rate by concentration, and in addition, the cell survival rate by concentration, excluding inflammatory derivatives, was measured to be toxic by concentration and subsequent experimental concentration was selected. Subsequent experiments were conducted in 20ug/ml and 50ug/ml, with compounds with lower cell survival rates than 50ug/ml. In the total flavonoid experiment, the contents were high in order of Rubus coreanus> Pueraria lobata flower E (ethanol extract) > Mokdanpip> blackcurrant in order of the total phenol experiment in order of Mokdanpi> Pueraria lobata flower E (ethanol extract)> > Vitex rotundifolia L. E > Vitex rotundifolia L. E (ethanol extract) > Rubus coreanus >blackcurrant. To determine the effect of suppressing inflammation, we conducted qRT-PCR of inflammatory cytokines. Throughout the DNCB induction experiment and LPS experiment, each compound significantly reduced the expression of inflammatory cytokines, especially DNCB as a Vitex rotundifolia L. and E as a galized LPS as a whole. In the ELISA experiment conducted to determine the amount of IL-6 secreted out of the cell, both concentration-dependent DNCB induction (Vitex rotundifolia L. = Pueraria lobata flower(ethanol extract) > blackcurrant) and LPS induction (Mokdanpipi > Vitex rotundifolia L. E(ethanol extract)> Rubus coreanus) experiments were reduced. The decline was the greatest among the Vitex rotundifolia L, Pueraria lobata flower E, and Mokdanpi The mRNA expression of TRL4, IKK-α and JNK was compared with the mRNA expression of each protein after the inhibitor induction to determine whether the inflammatory indicator reduction of each compound was due to the inhibition of the TRL4 signaling. As a result, in DNCB induction experiments, it is assumed that the Vitex rotundifolia L. and the Pueraria lobata flower E inhibits the expression of IKK-α in LPS induction experiments. It is believed to reduce the amount of inflammatory cytokines by inhibiting the expression of IKK-α and show the effect of suppressing inflammation.’ We conducted a western blots to compare the expression of IKK-α with the amount of IKK protein actually synthesized. In DNCB-induction experiments, the amount of protein significantly decreased compared to control, and P-IKK also decreased compared to CONTROL. In LPS-induction experiments, the amount of protein decreased significantly and in concentration dependence on the Vitex rotundifolia L. E (ethanol extract), the Pueraria lobata flower (ethanol extract), and the blackcurrant. In conclusion, it is assumed that in DNCB induction, the Vitex rotundifolia L. and Pueraria lobata flower E exhibit an inflammatory inhibition effect through inhibition of IKK-α. During lps induction, it is believed that the Vitex rotundifolia L. E(ethanol extract) and the Mokdanpi bimolecules show an inflammatory inhibition effect through the inhibition of IKK-α.
Atopic dermatitis is a chronic skin inflammatory disease that acts as a mental and physical stress such as itching, redness, obstruction of sleep, and taseonization. The cause of atopic dermatitis has yet to be determined. It has a high incidence rate of about 15-20% in childhood, with 1-3% in adults, and an increasing prevalence rate of 8 to 30% worldwide. It has been found to have a negative impact on the quality of life for patients and families, and direct and indirect medical costs also account for a significant portion. Atopic dermatitis is a disease that develops beyond extreme stress, food allergies, skin irritation, abnormalities in immune function, and genetic factors, so it is important to block and avoid antigen that becomes a starting substance. Treatments for atopic dermatitis include oral antihistamine, H2 antagonists, local steroids, tar therapy, and immunosuppressants. However, many treatments are known to have high rates of side effects and recurrence after treatment is stopped. Special attention should be paid to use and follow the doctor's instructions. Due to these problems, studies of herbal medicines and extracts with low side effects and inflammatory inhibition are required. TLR4 signaling, associated with the secretion of infectious cytokines, is a membrane protein that, when activated due to LPS, inflammatory cytokines, leads to the activation of the intracellular signaling pathway NF-kB and the activation of the signaling below, leading to inflammatory cytokines production of the immune system. In this study, HaCaT cell, a human skin keratin cell owner, was used to investigate the cell survival rate of each herbal drug and extract, Total phenol, Total flavonoid, qRT-PCR, ELISA, and western blots for inflammatory inhibition. The study was then conducted to investigate the inhibition of the signaling protein by processing the signal transporter in TLR4 signaling associated with inflammation. As a result of cell survival measurements, Vitex rotundifolia L. E, and blackcurrant showed high survival rates in the DNCB induction experiment, and in the LPS induction experiment, Vitex rotundifolia L. E, Pueraria lobata flower (ethanol extract), and bimolecules showed high survival rates. Each herbal medicine and extract increased their survival rate by concentration, and in addition, the cell survival rate by concentration, excluding inflammatory derivatives, was measured to be toxic by concentration and subsequent experimental concentration was selected. Subsequent experiments were conducted in 20ug/ml and 50ug/ml, with compounds with lower cell survival rates than 50ug/ml. In the total flavonoid experiment, the contents were high in order of Rubus coreanus> Pueraria lobata flower E (ethanol extract) > Mokdanpip> blackcurrant in order of the total phenol experiment in order of Mokdanpi> Pueraria lobata flower E (ethanol extract)> > Vitex rotundifolia L. E > Vitex rotundifolia L. E (ethanol extract) > Rubus coreanus >blackcurrant. To determine the effect of suppressing inflammation, we conducted qRT-PCR of inflammatory cytokines. Throughout the DNCB induction experiment and LPS experiment, each compound significantly reduced the expression of inflammatory cytokines, especially DNCB as a Vitex rotundifolia L. and E as a galized LPS as a whole. In the ELISA experiment conducted to determine the amount of IL-6 secreted out of the cell, both concentration-dependent DNCB induction (Vitex rotundifolia L. = Pueraria lobata flower(ethanol extract) > blackcurrant) and LPS induction (Mokdanpipi > Vitex rotundifolia L. E(ethanol extract)> Rubus coreanus) experiments were reduced. The decline was the greatest among the Vitex rotundifolia L, Pueraria lobata flower E, and Mokdanpi The mRNA expression of TRL4, IKK-α and JNK was compared with the mRNA expression of each protein after the inhibitor induction to determine whether the inflammatory indicator reduction of each compound was due to the inhibition of the TRL4 signaling. As a result, in DNCB induction experiments, it is assumed that the Vitex rotundifolia L. and the Pueraria lobata flower E inhibits the expression of IKK-α in LPS induction experiments. It is believed to reduce the amount of inflammatory cytokines by inhibiting the expression of IKK-α and show the effect of suppressing inflammation.’ We conducted a western blots to compare the expression of IKK-α with the amount of IKK protein actually synthesized. In DNCB-induction experiments, the amount of protein significantly decreased compared to control, and P-IKK also decreased compared to CONTROL. In LPS-induction experiments, the amount of protein decreased significantly and in concentration dependence on the Vitex rotundifolia L. E (ethanol extract), the Pueraria lobata flower (ethanol extract), and the blackcurrant. In conclusion, it is assumed that in DNCB induction, the Vitex rotundifolia L. and Pueraria lobata flower E exhibit an inflammatory inhibition effect through inhibition of IKK-α. During lps induction, it is believed that the Vitex rotundifolia L. E(ethanol extract) and the Mokdanpi bimolecules show an inflammatory inhibition effect through the inhibition of IKK-α.
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