종양 표적 박테리아의 프로그래밍에서 다양한 치료 유전자 또는 리포터 유전자의 발현은 서로 다른 유전자 발현 전략을 통하여 이루어집니다. 본 연구팀은 이전에 외인성 독시사이클린(Doxy)의 투여에만 반응하여 양방향 tet 프로모터에 의해 치료 및 영상을 위한 두 개의 유전자를 동시에 공동 발현하는 유도성 약물 전달 시스템으로 pJL87 플라스미드를 제작했다. 이 다중 카세트 발현 방식에서, tetA프로모터(PtetA)는 tetR 프로모터(PtetR)보다 단백질 발현 강도가 100배 더 높았다. 본 연구에서는 tet 프로모터를 기반으로 하는 새로운 Doxy 유도성 유전자 발현 시스템으로 pJH18 플라스미드를 개발했다. pJH18 시스템에서는 약한 항시발현 프로모터에 의해 발현된 Tet ...
종양 표적 박테리아의 프로그래밍에서 다양한 치료 유전자 또는 리포터 유전자의 발현은 서로 다른 유전자 발현 전략을 통하여 이루어집니다. 본 연구팀은 이전에 외인성 독시사이클린(Doxy)의 투여에만 반응하여 양방향 tet 프로모터에 의해 치료 및 영상을 위한 두 개의 유전자를 동시에 공동 발현하는 유도성 약물 전달 시스템으로 pJL87 플라스미드를 제작했다. 이 다중 카세트 발현 방식에서, tetA프로모터(PtetA)는 tetR 프로모터(PtetR)보다 단백질 발현 강도가 100배 더 높았다. 본 연구에서는 tet 프로모터를 기반으로 하는 새로운 Doxy 유도성 유전자 발현 시스템으로 pJH18 플라스미드를 개발했다. pJH18 시스템에서는 약한 항시발현 프로모터에 의해 발현된 Tet 억제인자 (TetR)는 tetO 오퍼레이터에 결합하여 PtetA 및 PtetR에 의한 유전자 발현을 억제하고 Doxy는 tetO에서 TetR을 유리시켜서 PtetA 및 PtetR의 억제를 해제한다. pJH18로 형질전환된 살모넬라에서 pJH18의 양방향 tet 프로모터의 발현 균형은 Doxy의 존재하에서 pJL87 (PtetA:PtetR = 100:1)과 비교하여 현저하게 개선되었다 (PtetA:PtetR = 4 ~ 6:1). 또한, 새로운 tet 시스템에 의한 발현 수준은 pJL87 보다 pJH18로 형질전환된 살모넬라에서 훨씬 더 높았다(rluc8에서 80배, clyA에서 5배). 흥미롭게도, pJH18이 세포 분열시 살모넬라의 플라스미드가 없는 집단이 생기는 것을 방지하는데 중요한 역할을 하는 bom 서열을 가지고 있기 때문에, pJH18로 형질전환된 살모넬라는 종양 보유 마우스에서 pJL87로 형질전환된 살모넬라보다 훨씬 더 안정적으로 플라스미드를 유지하였다(약 41배). 이를 바탕으로 여기에, 서는연구자는 치료효능을 극대화하기 위해 세포독성 단백질인 cytolysin A (ClyA)와 항암 선천 면역요법을 위한 우수한 보조제인 Vibrio vulnificus flagellin B(FlaB)를 종양 내 분비 및 조절하기 위한 프로그래밍 가능한 박테리아를 제작하였습니다. ClyA와 FlaB의 조합은 TLR4 작용제인 HMGB1 및 종양 특이적 항원(신생항원)을 방출하여 암세포 사멸을 유도할 뿐만 아니라 종양 내 표현형 및 기능적 활성형 대식세포를 촉진하여 생쥐 모델에서 종양을 억제한다. 항암 면역 반응의 가능성을 뒷받침하기 위해, 박테리아를 정맥 또는 종양 내 투여를 통해 다양한 종양 모델(CT26, MC38, 4T1, HCT116)에서 프로그램된 박테리아로 치료된 생쥐에서 선천적 면역세포, 활성화된 T세포 및 그에 상응하는 전신 면역기억 T세포의 증가를 관찰하였다. 마지막으로, 우리는 면역관문억제제와의 효과적인 조합을 통해 면역원성이 낮은 악성 흑색종 생쥐 모델에서 개선된 치료 효능을 확인하였다. 종합하면, 이러한 결과는 우리의 프로그래밍된 박테리아가 다중 면역치료제의 국소 전달에 사용되어 항종양 면역이 강화될 것임을 시사합니다.
종양 표적 박테리아의 프로그래밍에서 다양한 치료 유전자 또는 리포터 유전자의 발현은 서로 다른 유전자 발현 전략을 통하여 이루어집니다. 본 연구팀은 이전에 외인성 독시사이클린(Doxy)의 투여에만 반응하여 양방향 tet 프로모터에 의해 치료 및 영상을 위한 두 개의 유전자를 동시에 공동 발현하는 유도성 약물 전달 시스템으로 pJL87 플라스미드를 제작했다. 이 다중 카세트 발현 방식에서, tetA프로모터(PtetA)는 tetR 프로모터(PtetR)보다 단백질 발현 강도가 100배 더 높았다. 본 연구에서는 tet 프로모터를 기반으로 하는 새로운 Doxy 유도성 유전자 발현 시스템으로 pJH18 플라스미드를 개발했다. pJH18 시스템에서는 약한 항시발현 프로모터에 의해 발현된 Tet 억제인자 (TetR)는 tetO 오퍼레이터에 결합하여 PtetA 및 PtetR에 의한 유전자 발현을 억제하고 Doxy는 tetO에서 TetR을 유리시켜서 PtetA 및 PtetR의 억제를 해제한다. pJH18로 형질전환된 살모넬라에서 pJH18의 양방향 tet 프로모터의 발현 균형은 Doxy의 존재하에서 pJL87 (PtetA:PtetR = 100:1)과 비교하여 현저하게 개선되었다 (PtetA:PtetR = 4 ~ 6:1). 또한, 새로운 tet 시스템에 의한 발현 수준은 pJL87 보다 pJH18로 형질전환된 살모넬라에서 훨씬 더 높았다(rluc8에서 80배, clyA에서 5배). 흥미롭게도, pJH18이 세포 분열시 살모넬라의 플라스미드가 없는 집단이 생기는 것을 방지하는데 중요한 역할을 하는 bom 서열을 가지고 있기 때문에, pJH18로 형질전환된 살모넬라는 종양 보유 마우스에서 pJL87로 형질전환된 살모넬라보다 훨씬 더 안정적으로 플라스미드를 유지하였다(약 41배). 이를 바탕으로 여기에, 서는연구자는 치료효능을 극대화하기 위해 세포독성 단백질인 cytolysin A (ClyA)와 항암 선천 면역요법을 위한 우수한 보조제인 Vibrio vulnificus flagellin B(FlaB)를 종양 내 분비 및 조절하기 위한 프로그래밍 가능한 박테리아를 제작하였습니다. ClyA와 FlaB의 조합은 TLR4 작용제인 HMGB1 및 종양 특이적 항원(신생항원)을 방출하여 암세포 사멸을 유도할 뿐만 아니라 종양 내 표현형 및 기능적 활성형 대식세포를 촉진하여 생쥐 모델에서 종양을 억제한다. 항암 면역 반응의 가능성을 뒷받침하기 위해, 박테리아를 정맥 또는 종양 내 투여를 통해 다양한 종양 모델(CT26, MC38, 4T1, HCT116)에서 프로그램된 박테리아로 치료된 생쥐에서 선천적 면역세포, 활성화된 T세포 및 그에 상응하는 전신 면역기억 T세포의 증가를 관찰하였다. 마지막으로, 우리는 면역관문억제제와의 효과적인 조합을 통해 면역원성이 낮은 악성 흑색종 생쥐 모델에서 개선된 치료 효능을 확인하였다. 종합하면, 이러한 결과는 우리의 프로그래밍된 박테리아가 다중 면역치료제의 국소 전달에 사용되어 항종양 면역이 강화될 것임을 시사합니다.
In the programming of tumor-targeting bacteria, various therapeutic or reporter genes are expressed by different gene-triggering strategies. Previously, we engineered pJL87 plasmid with an inducible bacterial drug delivery system that simultaneously co-expressed two genes for therapy and imaging by ...
In the programming of tumor-targeting bacteria, various therapeutic or reporter genes are expressed by different gene-triggering strategies. Previously, we engineered pJL87 plasmid with an inducible bacterial drug delivery system that simultaneously co-expressed two genes for therapy and imaging by a bidirectional tet promoter system only in response to the administration of exogenous doxycycline (Doxy). In this multi-cassette expression approach, tetA promoter (PtetA) was 100-fold higher in expression strength than tetR promoter (PtetR). In the present study, we developed pJH18 plasmid with novel Doxy-inducible gene expression system based on a tet promoter.In this system, Tet repressor (TetR) expressed by a weak constitutive promoter binds to tetO operator, resulting in the tight repression of gene expressions by PtetA and PtetR, and Doxy releases TetR from tetO to de-repress PtetA and PtetR. In Salmonella transformed with pJH18, the expression balance of a bidirectional tet promoters in pJH18 was remarkably improved (PtetA : PtetR = 4 ~ 6 : 1) compared with that of pJL87 (PtetA : PtetR = 100 : 1) in the presence of Doxy. Also, the expression level by novel tet system was much higher in Salmonella transformed with pJH18 than in those with pJL87 (80-fold in rluc8 and 5-fold in clyA). Interestingly, pJH18 of the transformed Salmonella was much more stably maintained than pJL87 in antibiotic-free tumor-bearing mice (about 41-fold), because only pJH18 carries bom sequence with an essential role in preventing the plasmid-free population of programmed Salmonella from undergoing cell division. Based on that, here, we constructed programmable bacteria to control and intratumoral release of multiple payloads targeting cytolysin A (ClyA), a cytotoxic anticancer agent (3, 4) and Vibrio vulnificus flagellin B (FlaB), an excellent adjuvant for anticancer innate immunotherapy (5) for maximal therapeutic efficacy by using pJH18 vector. The combination of ClyA and FlaB not only induce cancer cell death to release HMGB1, a TLR4 agonist, and tumor-specific antigens (neoantigens) but also promote phenotypic and functional activation intratumoral macrophages, resulting in tumor suppression in syngeneic mouse models. Supporting the promising of a systemic anticancer immune response, we monitored a relative enhancement in innate immune cells, activated T cells, and corresponding increases in systemic immunological memory T cells in mice treated with programmed bacteria in various tumor models (CT26, MC38, 4T1, and HCT116) via bacterial intravenous or intratumoral administration. Last, we take advantages of our platform to achieved improved therapeutic efficacy in a poorly immunogenic mouse tumor model, B16F10 murine melanoma, through effective combination with immune checkpoint. Taken together, these results indicated that that our programmed bacteria would be used for safe and local delivery of multiple immunotherapeutic payloads resulting in enhanced systemic antitumor immunity.
In the programming of tumor-targeting bacteria, various therapeutic or reporter genes are expressed by different gene-triggering strategies. Previously, we engineered pJL87 plasmid with an inducible bacterial drug delivery system that simultaneously co-expressed two genes for therapy and imaging by a bidirectional tet promoter system only in response to the administration of exogenous doxycycline (Doxy). In this multi-cassette expression approach, tetA promoter (PtetA) was 100-fold higher in expression strength than tetR promoter (PtetR). In the present study, we developed pJH18 plasmid with novel Doxy-inducible gene expression system based on a tet promoter.In this system, Tet repressor (TetR) expressed by a weak constitutive promoter binds to tetO operator, resulting in the tight repression of gene expressions by PtetA and PtetR, and Doxy releases TetR from tetO to de-repress PtetA and PtetR. In Salmonella transformed with pJH18, the expression balance of a bidirectional tet promoters in pJH18 was remarkably improved (PtetA : PtetR = 4 ~ 6 : 1) compared with that of pJL87 (PtetA : PtetR = 100 : 1) in the presence of Doxy. Also, the expression level by novel tet system was much higher in Salmonella transformed with pJH18 than in those with pJL87 (80-fold in rluc8 and 5-fold in clyA). Interestingly, pJH18 of the transformed Salmonella was much more stably maintained than pJL87 in antibiotic-free tumor-bearing mice (about 41-fold), because only pJH18 carries bom sequence with an essential role in preventing the plasmid-free population of programmed Salmonella from undergoing cell division. Based on that, here, we constructed programmable bacteria to control and intratumoral release of multiple payloads targeting cytolysin A (ClyA), a cytotoxic anticancer agent (3, 4) and Vibrio vulnificus flagellin B (FlaB), an excellent adjuvant for anticancer innate immunotherapy (5) for maximal therapeutic efficacy by using pJH18 vector. The combination of ClyA and FlaB not only induce cancer cell death to release HMGB1, a TLR4 agonist, and tumor-specific antigens (neoantigens) but also promote phenotypic and functional activation intratumoral macrophages, resulting in tumor suppression in syngeneic mouse models. Supporting the promising of a systemic anticancer immune response, we monitored a relative enhancement in innate immune cells, activated T cells, and corresponding increases in systemic immunological memory T cells in mice treated with programmed bacteria in various tumor models (CT26, MC38, 4T1, and HCT116) via bacterial intravenous or intratumoral administration. Last, we take advantages of our platform to achieved improved therapeutic efficacy in a poorly immunogenic mouse tumor model, B16F10 murine melanoma, through effective combination with immune checkpoint. Taken together, these results indicated that that our programmed bacteria would be used for safe and local delivery of multiple immunotherapeutic payloads resulting in enhanced systemic antitumor immunity.
Keyword
#Tet system Salmonella Theranostics bacteria-mediated cancer therapy neoantigens
학위논문 정보
저자
응엔딩휘
학위수여기관
전남대학교
학위구분
국내박사
학과
분자의과학협동과정
지도교수
민정준
발행연도
2021
총페이지
122
키워드
Tet system Salmonella Theranostics bacteria-mediated cancer therapy neoantigens
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