식물은 오랜 시간에 걸쳐 인간과 함께 진화해온 생명체이다. 식물은 산소를 만들어 내며 동물에게 양분을 제공하기도 한다. 최근에는 의약품과 건강보조물질을 만들기 위해 식물을 이용한 단백질 생산에 대해 연구가 많이 진행되고 있는 상태이다. 식물을 이용한 분자농업은 동물세포를 이용하는 것에 비해 효율성과 안전성면에서 장점을 가진다. 식물 분자농업은 인간 병원체의 복제의 부재로 인해 안정성을 가지고 생산과정에서 무균시스템이 필요하지 않기에 단순하다. 또한, 4 주안에 대량으로 재배가 가능하여 빠르게 단백질을 얻을 수 있다는 큰 장점들을 갖는다. 식물을 이용하는 분자농업이 최근에 많은 연구가 진행중인 것과 달리, 식물자체를 연구하기 위한 분자적 연구는 오랜 시간동안 지속되어 왔다. 특히 고등식물에서의 건조스트레스 반응 기작에 대한 연구는 환경변화에 맞춰 많은 연구자들이 주목하고 있는 주제이다. 나는 석사학위 과정동안 식물을 이용한 분자농업과 우산이끼에서의 ...
식물은 오랜 시간에 걸쳐 인간과 함께 진화해온 생명체이다. 식물은 산소를 만들어 내며 동물에게 양분을 제공하기도 한다. 최근에는 의약품과 건강보조물질을 만들기 위해 식물을 이용한 단백질 생산에 대해 연구가 많이 진행되고 있는 상태이다. 식물을 이용한 분자농업은 동물세포를 이용하는 것에 비해 효율성과 안전성면에서 장점을 가진다. 식물 분자농업은 인간 병원체의 복제의 부재로 인해 안정성을 가지고 생산과정에서 무균시스템이 필요하지 않기에 단순하다. 또한, 4 주안에 대량으로 재배가 가능하여 빠르게 단백질을 얻을 수 있다는 큰 장점들을 갖는다. 식물을 이용하는 분자농업이 최근에 많은 연구가 진행중인 것과 달리, 식물자체를 연구하기 위한 분자적 연구는 오랜 시간동안 지속되어 왔다. 특히 고등식물에서의 건조스트레스 반응 기작에 대한 연구는 환경변화에 맞춰 많은 연구자들이 주목하고 있는 주제이다. 나는 석사학위 과정동안 식물을 이용한 분자농업과 우산이끼에서의 옥신과 관련된 E3 유비퀴틴 접합효소에 대해 연구를 진행했다. 첫 번째 주제는 담배를 이용한 분자농업에 대한 연구이다. 식물을 이용한 항체 생산은 효율성과 안전성으로 많은 장점을 갖지만 식물 특이적인 당화는 사람에게 알러지 반응을 일으킬 수 있다. 우리는 골지체에서 일어나는 식물 특이적인 당화를 막을 수 있도록 HDEL 을 이용해 소포체에 머무르게 하는 방법을 사용했다. 이후, Omalizumab 의 비강분비 치료제로서 사용 가능성을 연구하기 위해 단일사슬항체조각의 형태로 제작한 후 발현을 비교해 보았다. 우리는 Omalizumab 을 이용하여 연구를 진행하였다. Omalizumab 은 IgE 의 Fc 부분을 타겟팅 하여 히스타민의 분비를 낮춰주어 알러지 반응을 줄여주는 역할을 한다. 담배를 이용해 Omalizumab 을 발현시켜 항체를 얻는 방법을 이용하였고 C-terminal에 HDEL을 달아 식물 특이적인 당화가 골지체에서 일어나지 못하도록 제작하여 발현을 확인해보았다. 그 결과, 중사슬과 경사슬 각각의 발현은 좋았으나 이들의 적절한 결합이 잘 이루어지지 않는 것을 확인했다. 이후 Omalizumab 의 비강분비 치료제로서의 가능성에 대해 연구하기 위해 분자량이 작아 조직 투과성이 좋은 단일사슬항체조각의 형태로 만들었다. 이때, 단일사슬항체조각이 빨리 부서진다는 단점을 보완하기 위해 항체조각의 뒤에 사람혈청알부민 나노바디를 단 형태도 제작하였다. 이전과 동일하게 담배에 발현시켜 발현량을 확인해본 결과 예상과는 다르게 사람혈청알부민 나노바디를 붙이지 않은 단일사슬항체조각의 Omalizumab 이 발현이 훨씬 좋은 것을 확인하였다. 이를 통해 담배에서 Omalizumab 은 IgG 의 형태보다는 단일사슬항체조각의 형태의 발현이 더 좋은 것을 알 수 있었다. 이후, 이 결과를 이용해 단일사슬항체조각의 Omalizumab 을 정제하여 비강분비 치료제로서 가능성에 대해 연구할 수 있을 것으로 보인다. 두 번째 주제는 우산이끼에서 옥신과 관련된 E3 유비퀴틴 접합효소에 대한 연구이다. 우산이끼는 식물이 수생식물에서 육상식물로 진화하는 과정에서 중간에 있는 선태식물에 속하는 종으로 진화적 연구를 하기에 용이하다. 현재까지 육상식물에서 RING/U-BOX E3 유비퀴틴 접합효소는 건조스트레스에서 주요 조절자로 알려져 왔다. 우리는 초기식물인 우산이끼에서도 RING E3 유비퀴틴 접합효소가 같은 역할을 하는지 밝히고자 연구를 시작하였다. 연구를 진행하기 위해 우산이끼에서 건조스트레스에 유도되는 RING E3 유비퀴틴 접합효소들을 선별하였고 그 중 Mp0064s0081 는 건조스트레스에서 유도되는 유전자로 선택하였다. Mp0064s0081 는 막관통 도메인을 갖고 있기에 세포내 위치를 담배 잎을 통해 관찰해본 결과 ER-Golgi network 를 지나는 Trans golgi network 에 위치한다는 것을 알아냈다. 가운데에 존재하는 RING 도메인이 어느 방향에 위치하는지를 알아보는 실험을 통해 RING 도메인이 세포질을 향해 나와있는 것도 알 수 있었다. 이후, Mp0064s0081 이 우산이끼에서 어떠한 기능을 하는지 알아보기 위해 형질전환체를 제작하여 표현형 분석을 진행했다. 형질전환체는 우산이끼를 이용한 효율적인 체외 조직 배양 기술을 이용하여 제작하였으며 CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 mp0064s0081 유전자 제거 식물체를 제작하였다. 표현형 분석결과 Mp0064s0081 은 옥신 수송과 연관이 있을 것으로 예상되었고 실제 과발현체 식물에 옥신처리를 한 결과, Mp0064s0081 의 분자질량이 올라간 것을 확인하였다. 다음으로 E3 유비퀴틴 접합효소인 Mp0064s0081 의 타겟 단백질을 찾기 위해 효모단백질잡종법을 이용하여 Mp0014s0046 을 선별했으며 이후 두 단백질의 상호작용을 확인했다. Mp0014s0046 의 경우 실험을 통해 세포질에 위치해 있을 것으로 예상되기에 두 단백질은 세포질에서 만날 가능성이 존재한다. 지금까지의 연구를 통해 우산이끼에서 E3 유비퀴틴 접합효소에 대한 역할을 파악할 수 있었으며 우산이끼에 대해 연구할 수 있는 새로운 기반을 마련할 수 있었다.
식물은 오랜 시간에 걸쳐 인간과 함께 진화해온 생명체이다. 식물은 산소를 만들어 내며 동물에게 양분을 제공하기도 한다. 최근에는 의약품과 건강보조물질을 만들기 위해 식물을 이용한 단백질 생산에 대해 연구가 많이 진행되고 있는 상태이다. 식물을 이용한 분자농업은 동물세포를 이용하는 것에 비해 효율성과 안전성면에서 장점을 가진다. 식물 분자농업은 인간 병원체의 복제의 부재로 인해 안정성을 가지고 생산과정에서 무균시스템이 필요하지 않기에 단순하다. 또한, 4 주안에 대량으로 재배가 가능하여 빠르게 단백질을 얻을 수 있다는 큰 장점들을 갖는다. 식물을 이용하는 분자농업이 최근에 많은 연구가 진행중인 것과 달리, 식물자체를 연구하기 위한 분자적 연구는 오랜 시간동안 지속되어 왔다. 특히 고등식물에서의 건조스트레스 반응 기작에 대한 연구는 환경변화에 맞춰 많은 연구자들이 주목하고 있는 주제이다. 나는 석사학위 과정동안 식물을 이용한 분자농업과 우산이끼에서의 옥신과 관련된 E3 유비퀴틴 접합효소에 대해 연구를 진행했다. 첫 번째 주제는 담배를 이용한 분자농업에 대한 연구이다. 식물을 이용한 항체 생산은 효율성과 안전성으로 많은 장점을 갖지만 식물 특이적인 당화는 사람에게 알러지 반응을 일으킬 수 있다. 우리는 골지체에서 일어나는 식물 특이적인 당화를 막을 수 있도록 HDEL 을 이용해 소포체에 머무르게 하는 방법을 사용했다. 이후, Omalizumab 의 비강분비 치료제로서 사용 가능성을 연구하기 위해 단일사슬항체조각의 형태로 제작한 후 발현을 비교해 보았다. 우리는 Omalizumab 을 이용하여 연구를 진행하였다. Omalizumab 은 IgE 의 Fc 부분을 타겟팅 하여 히스타민의 분비를 낮춰주어 알러지 반응을 줄여주는 역할을 한다. 담배를 이용해 Omalizumab 을 발현시켜 항체를 얻는 방법을 이용하였고 C-terminal에 HDEL을 달아 식물 특이적인 당화가 골지체에서 일어나지 못하도록 제작하여 발현을 확인해보았다. 그 결과, 중사슬과 경사슬 각각의 발현은 좋았으나 이들의 적절한 결합이 잘 이루어지지 않는 것을 확인했다. 이후 Omalizumab 의 비강분비 치료제로서의 가능성에 대해 연구하기 위해 분자량이 작아 조직 투과성이 좋은 단일사슬항체조각의 형태로 만들었다. 이때, 단일사슬항체조각이 빨리 부서진다는 단점을 보완하기 위해 항체조각의 뒤에 사람혈청알부민 나노바디를 단 형태도 제작하였다. 이전과 동일하게 담배에 발현시켜 발현량을 확인해본 결과 예상과는 다르게 사람혈청알부민 나노바디를 붙이지 않은 단일사슬항체조각의 Omalizumab 이 발현이 훨씬 좋은 것을 확인하였다. 이를 통해 담배에서 Omalizumab 은 IgG 의 형태보다는 단일사슬항체조각의 형태의 발현이 더 좋은 것을 알 수 있었다. 이후, 이 결과를 이용해 단일사슬항체조각의 Omalizumab 을 정제하여 비강분비 치료제로서 가능성에 대해 연구할 수 있을 것으로 보인다. 두 번째 주제는 우산이끼에서 옥신과 관련된 E3 유비퀴틴 접합효소에 대한 연구이다. 우산이끼는 식물이 수생식물에서 육상식물로 진화하는 과정에서 중간에 있는 선태식물에 속하는 종으로 진화적 연구를 하기에 용이하다. 현재까지 육상식물에서 RING/U-BOX E3 유비퀴틴 접합효소는 건조스트레스에서 주요 조절자로 알려져 왔다. 우리는 초기식물인 우산이끼에서도 RING E3 유비퀴틴 접합효소가 같은 역할을 하는지 밝히고자 연구를 시작하였다. 연구를 진행하기 위해 우산이끼에서 건조스트레스에 유도되는 RING E3 유비퀴틴 접합효소들을 선별하였고 그 중 Mp0064s0081 는 건조스트레스에서 유도되는 유전자로 선택하였다. Mp0064s0081 는 막관통 도메인을 갖고 있기에 세포내 위치를 담배 잎을 통해 관찰해본 결과 ER-Golgi network 를 지나는 Trans golgi network 에 위치한다는 것을 알아냈다. 가운데에 존재하는 RING 도메인이 어느 방향에 위치하는지를 알아보는 실험을 통해 RING 도메인이 세포질을 향해 나와있는 것도 알 수 있었다. 이후, Mp0064s0081 이 우산이끼에서 어떠한 기능을 하는지 알아보기 위해 형질전환체를 제작하여 표현형 분석을 진행했다. 형질전환체는 우산이끼를 이용한 효율적인 체외 조직 배양 기술을 이용하여 제작하였으며 CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 mp0064s0081 유전자 제거 식물체를 제작하였다. 표현형 분석결과 Mp0064s0081 은 옥신 수송과 연관이 있을 것으로 예상되었고 실제 과발현체 식물에 옥신처리를 한 결과, Mp0064s0081 의 분자질량이 올라간 것을 확인하였다. 다음으로 E3 유비퀴틴 접합효소인 Mp0064s0081 의 타겟 단백질을 찾기 위해 효모단백질잡종법을 이용하여 Mp0014s0046 을 선별했으며 이후 두 단백질의 상호작용을 확인했다. Mp0014s0046 의 경우 실험을 통해 세포질에 위치해 있을 것으로 예상되기에 두 단백질은 세포질에서 만날 가능성이 존재한다. 지금까지의 연구를 통해 우산이끼에서 E3 유비퀴틴 접합효소에 대한 역할을 파악할 수 있었으며 우산이끼에 대해 연구할 수 있는 새로운 기반을 마련할 수 있었다.
Plants have evolved with humans for a long time. They produce oxygen and provide nutrients to animals. Recently, a lot of research has been conducted on protein production using plants to make pharmaceuticals and health supplements. Plant molecular farming has advantages in terms of efficiency and s...
Plants have evolved with humans for a long time. They produce oxygen and provide nutrients to animals. Recently, a lot of research has been conducted on protein production using plants to make pharmaceuticals and health supplements. Plant molecular farming has advantages in terms of efficiency and safety compared to the use of animal cells. The protein production using plants is safety and simplicity because they have stability due to the absence of replication of human pathogens and do not require sterility in the production process. In addition, it has great advantages of being able to grow in large quantities within 4 weeks, so can quickly obtain proteins. While many studies on molecular farming using plants have been conducted recently, molecular research to study plants has lasted for a long time. Research on the drought stress resistance mechanism in higher plants is a topic that many researchers are especially paying attention to in line with environmental changes. During my master's degree, I conducted a study on plant-based molecular farming and E3 ubiquitin ligase related to Auxin in Marchantia polymorpha. Chapter Ⅰ is the study of molecular farming using N.benthamiana. Antibody production using plants has many advantages in efficiency and safety, but plant-specific glycosylation can cause allergic reactions in humans. To prevent plant-specific glycosylation occurring in the Golgi, HDEL sequence was used to retain proteins in the ER vesicles. After that, to study the possibility of using omalizumab as a intranasal administration, scFv (single-chain variable fragment) form was constructed and then the expression level was compared. We conducted a study using Omalizumab. Omalizumab targets the Fc region of free IgE to decrease the secretion of histamine and thus reduces allergic reactions. N.benthamiana was used to obtain antibodies by expressing Omalizumab. HDEL sequence was tagged to prevent plant-specific glycosylation occurring in the Golgi. The expression of each of the heavy chain and the light chain was successful, but the proper folding and assembly of the heavy chain and the light chain were not observed. Additionally, to study the possibility of Omalizumab as a intranasal administration, we constructed a scFv form of Omalizumab with efficient tissue permeability due to its small molecular weight. Simultaneously, to complement for the shortcoming that scFv form degrades quickly, a form with an HSA (human serum albumin) nanobody was also constructed. The expression test was conducted same as IgG form. When we confirmed the expression amount by expressing it in N.benthamiana, unexpectedly, it was confirmed that scFv form of Omalizumab without HSA nanobody showed better expression level. Through this results, we found that Omalizumab showed better expression level in the form of scFv than in the form of IgG in N.benthamiana. According to the results, it seems that these results will be helpful to study the possibility as a intranasal administration medicine by performing further study. Chapter Ⅱ is a study about E3 ubiquitin ligase associated with Auxin in Marchantia polymorpha. Marchantia polymorpha was used as a model plant to research evolutionary process because it belongs to the bryophyte, an intermediate that plants have evolved from hydrophytes to terrestrial plants. Currently, RING/U-BOX E3 ubiquitin ligases have been known as major regulators under drought stress in terrestrial plants. Therefore, we started a study to investigate whether the functions of RING E3 ubiquitin ligases are conserved in Marchantia polymorpha. RING E3 ubiquitin ligases induced under drought stress were screened in Marchantia polymorpha, and Mp0064s0081 was selected as a drought stress induced gene. By subcellular localization, cell fractionation, and topology assays, we can figure out that Mp0064s0081 is in TGN (Trans-golgi network). Then, transformants were generated using an efficient in vitro tissue culture technology and CRISPR/Cas9 system. 35S:3xFlag-Mp0064s0081 overexpressing transgenic plants and mp0064s0081 loss-of-function mutants were used to find the function of Mp0064s0081. As a result of phenotypic analysis, Mp0064s0081 was expected to be related to Auxin transport. And the relation between Mp0064s0081 and Auxin was confirmed by shifting molecular weight. Via yeast two-hybrid screening, Mp0014s0046 was selected as a putative target protein of Mp0064s0081. Their interaction was confirmed by yeast two-hybrid, and pull-down assays. Through this study, the role of E3 ubiquitin ligase in Marchantia polymorpha was identified and new foundation was laid for studying molecular evolutionary progress in Marchantia polymorpha.
Plants have evolved with humans for a long time. They produce oxygen and provide nutrients to animals. Recently, a lot of research has been conducted on protein production using plants to make pharmaceuticals and health supplements. Plant molecular farming has advantages in terms of efficiency and safety compared to the use of animal cells. The protein production using plants is safety and simplicity because they have stability due to the absence of replication of human pathogens and do not require sterility in the production process. In addition, it has great advantages of being able to grow in large quantities within 4 weeks, so can quickly obtain proteins. While many studies on molecular farming using plants have been conducted recently, molecular research to study plants has lasted for a long time. Research on the drought stress resistance mechanism in higher plants is a topic that many researchers are especially paying attention to in line with environmental changes. During my master's degree, I conducted a study on plant-based molecular farming and E3 ubiquitin ligase related to Auxin in Marchantia polymorpha. Chapter Ⅰ is the study of molecular farming using N.benthamiana. Antibody production using plants has many advantages in efficiency and safety, but plant-specific glycosylation can cause allergic reactions in humans. To prevent plant-specific glycosylation occurring in the Golgi, HDEL sequence was used to retain proteins in the ER vesicles. After that, to study the possibility of using omalizumab as a intranasal administration, scFv (single-chain variable fragment) form was constructed and then the expression level was compared. We conducted a study using Omalizumab. Omalizumab targets the Fc region of free IgE to decrease the secretion of histamine and thus reduces allergic reactions. N.benthamiana was used to obtain antibodies by expressing Omalizumab. HDEL sequence was tagged to prevent plant-specific glycosylation occurring in the Golgi. The expression of each of the heavy chain and the light chain was successful, but the proper folding and assembly of the heavy chain and the light chain were not observed. Additionally, to study the possibility of Omalizumab as a intranasal administration, we constructed a scFv form of Omalizumab with efficient tissue permeability due to its small molecular weight. Simultaneously, to complement for the shortcoming that scFv form degrades quickly, a form with an HSA (human serum albumin) nanobody was also constructed. The expression test was conducted same as IgG form. When we confirmed the expression amount by expressing it in N.benthamiana, unexpectedly, it was confirmed that scFv form of Omalizumab without HSA nanobody showed better expression level. Through this results, we found that Omalizumab showed better expression level in the form of scFv than in the form of IgG in N.benthamiana. According to the results, it seems that these results will be helpful to study the possibility as a intranasal administration medicine by performing further study. Chapter Ⅱ is a study about E3 ubiquitin ligase associated with Auxin in Marchantia polymorpha. Marchantia polymorpha was used as a model plant to research evolutionary process because it belongs to the bryophyte, an intermediate that plants have evolved from hydrophytes to terrestrial plants. Currently, RING/U-BOX E3 ubiquitin ligases have been known as major regulators under drought stress in terrestrial plants. Therefore, we started a study to investigate whether the functions of RING E3 ubiquitin ligases are conserved in Marchantia polymorpha. RING E3 ubiquitin ligases induced under drought stress were screened in Marchantia polymorpha, and Mp0064s0081 was selected as a drought stress induced gene. By subcellular localization, cell fractionation, and topology assays, we can figure out that Mp0064s0081 is in TGN (Trans-golgi network). Then, transformants were generated using an efficient in vitro tissue culture technology and CRISPR/Cas9 system. 35S:3xFlag-Mp0064s0081 overexpressing transgenic plants and mp0064s0081 loss-of-function mutants were used to find the function of Mp0064s0081. As a result of phenotypic analysis, Mp0064s0081 was expected to be related to Auxin transport. And the relation between Mp0064s0081 and Auxin was confirmed by shifting molecular weight. Via yeast two-hybrid screening, Mp0014s0046 was selected as a putative target protein of Mp0064s0081. Their interaction was confirmed by yeast two-hybrid, and pull-down assays. Through this study, the role of E3 ubiquitin ligase in Marchantia polymorpha was identified and new foundation was laid for studying molecular evolutionary progress in Marchantia polymorpha.
주제어
#Molecular farming Nicotiana benthamiana Omalizumab Marchantia polymorpha Auxin transport Auxin RING E3 ubiquitin ligases CRISPR/Cas9 system
학위논문 정보
저자
김소정
학위수여기관
Graduate School, Yonsei University
학위구분
국내석사
학과
Department of Systems Biology
지도교수
Woo Taek Kim
발행연도
2022
총페이지
viii, 57장
키워드
Molecular farming Nicotiana benthamiana Omalizumab Marchantia polymorpha Auxin transport Auxin RING E3 ubiquitin ligases CRISPR/Cas9 system
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