수산양식산업은 전 세계에서 가장 빠르게 성장하는 식량 생산 시스템으로, 미래 식량자원 확보를 위한 중요한 산업분야이다. 이에 수산물의 생산량을 증가시키기 위해 양식품종의 중요 경제형질을 개량하기 위한 노력이 이어지고 있다. 속성장, 내병성 강화 등이 유전적 개량의 주요 목표로, 이를 위한 양식품종의 개량이 진행되고 있다. 유전체 교정기술은 목표 유전자를 표적함으로써 동물의 형질 개량을 가능하게 하는 강력한 기술로 주목받고 있다. 특히 3세대 ...
수산양식산업은 전 세계에서 가장 빠르게 성장하는 식량 생산 시스템으로, 미래 식량자원 확보를 위한 중요한 산업분야이다. 이에 수산물의 생산량을 증가시키기 위해 양식품종의 중요 경제형질을 개량하기 위한 노력이 이어지고 있다. 속성장, 내병성 강화 등이 유전적 개량의 주요 목표로, 이를 위한 양식품종의 개량이 진행되고 있다. 유전체 교정기술은 목표 유전자를 표적함으로써 동물의 형질 개량을 가능하게 하는 강력한 기술로 주목받고 있다. 특히 3세대 유전자 가위CRISPR/Cas9 시스템은 유전체 교정의 정확도와 효율이 높은 혁신 기술로 어류의 형질개량에 활용될 수 있다. 본 연구에서는 우리나라에서 가장 경제성 높은 양식품종인 넙치를 대상으로, 주요 경제형질인 속성장과 내병성에 관련된 유전자의 기능 연구를 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 활용하였다. Myostatin(MSTN)은 근육의 발생과 성장을 억제하는 유전자로, 어류를 포함한 척추동물의 성장을 촉진하기 위해 표적이 되는 주요 유전자이다. 먼저 CRISPR 구성물질을 넙치 수정란에 주입시키기 위해서 넙치 수정란에 최적화된 유전자 미세주입기술을 최초로 개발하였다. 그리고 넙치 MSTN 유전자의 첫번째 exon을 표적하는 sgRNA를 제작하여 Cas9 mRNA와 함께 넙치 수정란에 미세주입하였다. 이를 통해 MSTN 유전자 좌위에 돌연변이가 발생한 넙치를 생산하고(F0 세대) 이를 친어로서 교배하여 다음 세대에서 상동염색체의 두 대립유전자에 돌연변이를 가진 MSTN 편집 넙치를 생산하였다(F1 세대). MSTN 편집 넙치는 근육 과형성에 의한 근성장을 통해 체고 및 비만도가 증가하였다. 또한 MSTN 편집 넙치의 근육조직에서 MSTN 및 주요 근육생성조절인자인 myogenin, MyoD, Myf5의 유전자 발현을 조사하였다. MAF1은 RNA polymerase III 매개로 한 전사의 억제 유전자로, 효모에서 인간에 이르기까지 진화적으로 보존되어 있다. 최근 연구에서 포유류의 면역 반응에 MAF1이 관여함이 암시된 바 있다. 본 연구에서는 먼저 어류에서는 최초로 넙치의 Maf1 유전자를 분리하여 동정하였다. Maf1 유전자 염기서열에서 추론된 아미노산 서열은 다른 척추동물의 MAF1 orthologue와 공통된 특성을 가졌다. Maf1 mRNA는 넙치 조직 전반에서 발현되었으며 눈과 근육 조직에서 발현이 높았다. Maf1 mRNA는 넙치 초기발생단계에서 접점 증가하는 발현 양상을 보였다. 또한 넙치 유래의 HINAE 세포에서 Maf1 mRNA 발현을 조사하였을 때 어류에 치명적인 바이러스성 질병인 바이러스성출혈성패혈증바이러스(VHSV) 감염에 의해 Maf1 mRNA의 발현이 감소하였다. MAF1의 기능을 심층적으로 조사하기 위해 Maf1 특이적인 sgRNA를 제작하여 배양세포용 유전체 교정을 위한 Cas9/sgRNA binary벡터를 제작하였다. 단일세포 유래 MAF1 편집 HINAE 세포주를 개발하여 VHSV 감염에 대한 MAF1의 기능을 조사하였다. VHSV 감염시 MAF1 knockout에 의해 VHSV glycoprotein의 mRNA 발현이 증가하였고 면역반응 관련 유전자인 IFN의 mRNA 발현이 증가하였다. 이 결과는 넙치 MAF1이 VHSV 감염에 의한 면역반응에 관여함을 시사한다. 본 연구는 중요 양식품종인 넙치에 최초로 in vivo와 in vitro 모델 모두에 유전체 교정기술을 적용하였다는 의의가 있다. 이 과정에서 넙치 수정란에 최적화된 미세주입 기술을 개발하였다. 이는 유전체 교정 기술뿐만 아니라 유전자 조작 기술을 넙치에 적용할 수 있는 범용성 높은 기반 기술로 유용하게 활용될 수 있다. 또한 넙치 MSTN과 Maf1 유전자가 각각 속성장, 내병성 형질에 관여함을 시사하여, 각 경제형질에 대한 이해를 높일 뿐만 아니라 형질 개량을 위한 표적 유전자로써 어류의 형질개량 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
수산양식산업은 전 세계에서 가장 빠르게 성장하는 식량 생산 시스템으로, 미래 식량자원 확보를 위한 중요한 산업분야이다. 이에 수산물의 생산량을 증가시키기 위해 양식품종의 중요 경제형질을 개량하기 위한 노력이 이어지고 있다. 속성장, 내병성 강화 등이 유전적 개량의 주요 목표로, 이를 위한 양식품종의 개량이 진행되고 있다. 유전체 교정기술은 목표 유전자를 표적함으로써 동물의 형질 개량을 가능하게 하는 강력한 기술로 주목받고 있다. 특히 3세대 유전자 가위 CRISPR/Cas9 시스템은 유전체 교정의 정확도와 효율이 높은 혁신 기술로 어류의 형질개량에 활용될 수 있다. 본 연구에서는 우리나라에서 가장 경제성 높은 양식품종인 넙치를 대상으로, 주요 경제형질인 속성장과 내병성에 관련된 유전자의 기능 연구를 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 활용하였다. Myostatin(MSTN)은 근육의 발생과 성장을 억제하는 유전자로, 어류를 포함한 척추동물의 성장을 촉진하기 위해 표적이 되는 주요 유전자이다. 먼저 CRISPR 구성물질을 넙치 수정란에 주입시키기 위해서 넙치 수정란에 최적화된 유전자 미세주입기술을 최초로 개발하였다. 그리고 넙치 MSTN 유전자의 첫번째 exon을 표적하는 sgRNA를 제작하여 Cas9 mRNA와 함께 넙치 수정란에 미세주입하였다. 이를 통해 MSTN 유전자 좌위에 돌연변이가 발생한 넙치를 생산하고(F0 세대) 이를 친어로서 교배하여 다음 세대에서 상동염색체의 두 대립유전자에 돌연변이를 가진 MSTN 편집 넙치를 생산하였다(F1 세대). MSTN 편집 넙치는 근육 과형성에 의한 근성장을 통해 체고 및 비만도가 증가하였다. 또한 MSTN 편집 넙치의 근육조직에서 MSTN 및 주요 근육생성조절인자인 myogenin, MyoD, Myf5의 유전자 발현을 조사하였다. MAF1은 RNA polymerase III 매개로 한 전사의 억제 유전자로, 효모에서 인간에 이르기까지 진화적으로 보존되어 있다. 최근 연구에서 포유류의 면역 반응에 MAF1이 관여함이 암시된 바 있다. 본 연구에서는 먼저 어류에서는 최초로 넙치의 Maf1 유전자를 분리하여 동정하였다. Maf1 유전자 염기서열에서 추론된 아미노산 서열은 다른 척추동물의 MAF1 orthologue와 공통된 특성을 가졌다. Maf1 mRNA는 넙치 조직 전반에서 발현되었으며 눈과 근육 조직에서 발현이 높았다. Maf1 mRNA는 넙치 초기발생단계에서 접점 증가하는 발현 양상을 보였다. 또한 넙치 유래의 HINAE 세포에서 Maf1 mRNA 발현을 조사하였을 때 어류에 치명적인 바이러스성 질병인 바이러스성출혈성패혈증바이러스(VHSV) 감염에 의해 Maf1 mRNA의 발현이 감소하였다. MAF1의 기능을 심층적으로 조사하기 위해 Maf1 특이적인 sgRNA를 제작하여 배양세포용 유전체 교정을 위한 Cas9/sgRNA binary 벡터를 제작하였다. 단일세포 유래 MAF1 편집 HINAE 세포주를 개발하여 VHSV 감염에 대한 MAF1의 기능을 조사하였다. VHSV 감염시 MAF1 knockout에 의해 VHSV glycoprotein의 mRNA 발현이 증가하였고 면역반응 관련 유전자인 IFN의 mRNA 발현이 증가하였다. 이 결과는 넙치 MAF1이 VHSV 감염에 의한 면역반응에 관여함을 시사한다. 본 연구는 중요 양식품종인 넙치에 최초로 in vivo와 in vitro 모델 모두에 유전체 교정기술을 적용하였다는 의의가 있다. 이 과정에서 넙치 수정란에 최적화된 미세주입 기술을 개발하였다. 이는 유전체 교정 기술뿐만 아니라 유전자 조작 기술을 넙치에 적용할 수 있는 범용성 높은 기반 기술로 유용하게 활용될 수 있다. 또한 넙치 MSTN과 Maf1 유전자가 각각 속성장, 내병성 형질에 관여함을 시사하여, 각 경제형질에 대한 이해를 높일 뿐만 아니라 형질 개량을 위한 표적 유전자로써 어류의 형질개량 연구에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
Aquaculture is the world's fastest-growing food production system for decades. The major ongoing challenge is to improve economically important traits in aquaculture species for greater production performance. Growth rate, disease resistance and product quality are major traits of interest for genet...
Aquaculture is the world's fastest-growing food production system for decades. The major ongoing challenge is to improve economically important traits in aquaculture species for greater production performance. Growth rate, disease resistance and product quality are major traits of interest for genetic improvements of aquaculture species. For genetic improvement of fish, genome editing technology has proven to be a powerful system to generate gene-targeted modified animal including fish. Recently, clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) system has been considered the most revolutionary tool for genome editing with high precision and efficiency. In this study, CRISPR/Cas9 system was applied to investigate the role of genes related to economically important traits—growth rate and disease resistance—in olive flounder P. olivaceus, which is one of the most commercially important marine fish in Asian countries including Korea, Japan and China. Myostatin (MSTN), a negative regulator of muscle mass development and growth, is the major gene of interest for improving growth rate in vertebrates including fish. With the aim to introduce CRISPR/Cas9 system to edit MSTN gene, microinjection system was first developed to deliver CRISPR components to generate edited embryos for the first time in P. olivaceus. Cas9 mRNA and single guide RNAs (sgRNAs) targeting the first exon of the P. olivaceus MSTN (PoMSTN) gene were co-injected into embryos of P. olivaceus. On-target mutations on the PoMSTN locus were generated in F0 generation, and heterozygous biallelic mutants with PoMSTN knockout were obtained in the F1 generation. PoMSTN-disrupted P. olivaceus exhibited greater body thickness and higher condition factor, indicating the enhancement of muscle growth with muscle hyperplasia. The expression levels of PoMSTN and major myogenic regulatory factors (myogenin, MyoD, and Myf5) were determined in PoMSTN-disrupted mutants. MAF1, a global suppressor of RNA polymerase III-dependent transcription, is conserved from yeast to human. Evidence is emerging that MAF1 is involved in the immune response of mammals. For the first time in fish, Maf1 was identified and characterized from P. olivaceus (PoMaf1). The deduced PoMAF1 amino acid sequence shared common features with those of MAF1 orthologues from vertebrates. PoMaf1 mRNA was expressed in all tissues tested, with the highest expressions detected in eye and muscle tissue. The mRNA level of PoMaf1 was increased during early development. In flounder Hirame natural embryo (HINAE) cells, the PoMaf1 mRNA level decreased during viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) infection. PoMaf1-specific sgRNA was designed and Cas9/sgRNA binary expression vector for the CRISPR/Cas9 system was constructed to achieve genome editing in cell culture system. Single-cell-derived PoMAF1 knockout HINAE cells were then generate and the role of PoMAF1 in VHSV infection was investigated. PoMAF1 disruption increased the VHSV glycoprotein (G) transcript levels and innate immune response gene IFN during VHSV infection of HINAE cells, suggesting the role of PoMAF1 in the immune response to VSHV infection. This study is the first to apply genome editing technology in P. olivaceus both in vivo and in vitro. Optimized microinjection technology enables further application of not only genome editing but also transgenic technology in P. olivaceus. PoMSTN and PoMaf1 genes were suggested to be potential targets of major traits for genetic improvement of P. olivaceus, growth rate and disease resistance, respectively.
Aquaculture is the world's fastest-growing food production system for decades. The major ongoing challenge is to improve economically important traits in aquaculture species for greater production performance. Growth rate, disease resistance and product quality are major traits of interest for genetic improvements of aquaculture species. For genetic improvement of fish, genome editing technology has proven to be a powerful system to generate gene-targeted modified animal including fish. Recently, clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) system has been considered the most revolutionary tool for genome editing with high precision and efficiency. In this study, CRISPR/Cas9 system was applied to investigate the role of genes related to economically important traits—growth rate and disease resistance—in olive flounder P. olivaceus, which is one of the most commercially important marine fish in Asian countries including Korea, Japan and China. Myostatin (MSTN), a negative regulator of muscle mass development and growth, is the major gene of interest for improving growth rate in vertebrates including fish. With the aim to introduce CRISPR/Cas9 system to edit MSTN gene, microinjection system was first developed to deliver CRISPR components to generate edited embryos for the first time in P. olivaceus. Cas9 mRNA and single guide RNAs (sgRNAs) targeting the first exon of the P. olivaceus MSTN (PoMSTN) gene were co-injected into embryos of P. olivaceus. On-target mutations on the PoMSTN locus were generated in F0 generation, and heterozygous biallelic mutants with PoMSTN knockout were obtained in the F1 generation. PoMSTN-disrupted P. olivaceus exhibited greater body thickness and higher condition factor, indicating the enhancement of muscle growth with muscle hyperplasia. The expression levels of PoMSTN and major myogenic regulatory factors (myogenin, MyoD, and Myf5) were determined in PoMSTN-disrupted mutants. MAF1, a global suppressor of RNA polymerase III-dependent transcription, is conserved from yeast to human. Evidence is emerging that MAF1 is involved in the immune response of mammals. For the first time in fish, Maf1 was identified and characterized from P. olivaceus (PoMaf1). The deduced PoMAF1 amino acid sequence shared common features with those of MAF1 orthologues from vertebrates. PoMaf1 mRNA was expressed in all tissues tested, with the highest expressions detected in eye and muscle tissue. The mRNA level of PoMaf1 was increased during early development. In flounder Hirame natural embryo (HINAE) cells, the PoMaf1 mRNA level decreased during viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) infection. PoMaf1-specific sgRNA was designed and Cas9/sgRNA binary expression vector for the CRISPR/Cas9 system was constructed to achieve genome editing in cell culture system. Single-cell-derived PoMAF1 knockout HINAE cells were then generate and the role of PoMAF1 in VHSV infection was investigated. PoMAF1 disruption increased the VHSV glycoprotein (G) transcript levels and innate immune response gene IFN during VHSV infection of HINAE cells, suggesting the role of PoMAF1 in the immune response to VSHV infection. This study is the first to apply genome editing technology in P. olivaceus both in vivo and in vitro. Optimized microinjection technology enables further application of not only genome editing but also transgenic technology in P. olivaceus. PoMSTN and PoMaf1 genes were suggested to be potential targets of major traits for genetic improvement of P. olivaceus, growth rate and disease resistance, respectively.
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