일반적으로 다수의 유전자 분석을 수행하기 위해서는 충분히 많은 양의 DNA가 필요하다. 하지만 사건 현장 시료에서 추출한 DNA는 분해되어 있거나, sub-nanogram (<1ng) 수준의 미량으로 회수되는 경우가 빈번하여 이후 진행되는 유전자 분석의 범위를 제한하고, 신뢰하기 어려운 분석 결과를 만들어낸다. 한편, 법유전학 영역에서는 차세대 염기서열 분석법 (Next generation sequencing, NGS)의 활용도가 높아짐에 따라 미량 DNA를 대상으로 짧은 길이로 분석이 가능한 단일 염기 다형성 (Single nucleotide polymorphism, ...
일반적으로 다수의 유전자 분석을 수행하기 위해서는 충분히 많은 양의 DNA가 필요하다. 하지만 사건 현장 시료에서 추출한 DNA는 분해되어 있거나, sub-nanogram (<1ng) 수준의 미량으로 회수되는 경우가 빈번하여 이후 진행되는 유전자 분석의 범위를 제한하고, 신뢰하기 어려운 분석 결과를 만들어낸다. 한편, 법유전학 영역에서는 차세대 염기서열 분석법 (Next generation sequencing, NGS)의 활용도가 높아짐에 따라 미량 DNA를 대상으로 짧은 길이로 분석이 가능한 단일 염기 다형성 (Single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 NGS 분석하는 연구가 진행되어 오고 있다. SNP 마커는 대부분 두 개의 대립유전자를 가져 식별력이 비교적 낮기 때문에 많은 수의 마커를 동시에 분석해야 높은 식별력을 얻을 수 있다. 패널을 유연하게 확장하여 다수의 SNP 마커를 분석하기 위해 hybrid capture 기반의 target enrichment 방식이 도입되는 추세이다. 현재까지 미량 DNA를 대상으로 SNP의 hybrid capture를 위한 NGS 라이브러리 (library) 생성은 주로 low-input DNA library preparation kits를 사용하여 수행되어왔다. 하지만 기존에 사용하고 있는 방법은 일정 양 이상의 input DNA를 필요로 하며, input DNA의 양이 줄어들수록 라이브러리 complexity가 줄어드는 한계가 있다. 본 연구에서는 이러한 한계를 극복하고 분석 효율을 높이기 위하여 전장 유전체 증폭 (Whole genome amplification, WGA) 방법을 대안으로 제시하고 유용성을 검증하고자 하였다. 이에, 본 연구에서는 4개 인구 집단에 속하는 5명의 남성 시료를 sub-nanogram 수준으로 연속 희석하여 개인 식별에 유용한 136개의 identity-informative SNP에 대한 hybrid capture 기반 NGS 분석을 수행하고, input DNA의 양 감소와 WGA 수행 유무에 따른 NGS 결과를 비교 분석하였다. Genomic DNA (gDNA) 라이브러리와 비교하여 WGA DNA 라이브러리의 경우 input DNA 양 감소에 관계없이 on-target rate, on-SNP rate에서 보다 안정적인 결과를 확보할 수 있었고, genotype recovery rate가 최대 27배까지 상당히 증가함이 확인되었다. 나아가, duplicate rate 비교를 통해 미량 DNA를 대상으로 WGA를 수행하면 라이브러리 complexity가 개선되는 것을 유추해볼 수 있었다. 본 연구에서는 법과학 실무에서 어려움을 겪는 미량 DNA 분석 결과를 개선하는 대안으로 WGA 수행의 효용성을 보여주었다. 본 연구에서 구축한 방법은 현재 사용하고 있는 방법으로는 해결이 어려운 미량 DNA 분석에 적용하여 개인 신원확인 특정율을 높이고 수사 단서 획득에 기여할 것으로 사료된다. 나아가, 본 연구를 기반으로 얻어진 identity-informative SNP에 대한 NGS 결과는 추후 법과학 실무에서 다양하게 활용 가능한 대규모의 forensic SNP 패널로의 확장 전략을 수립하는데 유용하게 활용될 것으로 사료된다.
일반적으로 다수의 유전자 분석을 수행하기 위해서는 충분히 많은 양의 DNA가 필요하다. 하지만 사건 현장 시료에서 추출한 DNA는 분해되어 있거나, sub-nanogram (<1ng) 수준의 미량으로 회수되는 경우가 빈번하여 이후 진행되는 유전자 분석의 범위를 제한하고, 신뢰하기 어려운 분석 결과를 만들어낸다. 한편, 법유전학 영역에서는 차세대 염기서열 분석법 (Next generation sequencing, NGS)의 활용도가 높아짐에 따라 미량 DNA를 대상으로 짧은 길이로 분석이 가능한 단일 염기 다형성 (Single nucleotide polymorphism, SNP) 마커를 NGS 분석하는 연구가 진행되어 오고 있다. SNP 마커는 대부분 두 개의 대립유전자를 가져 식별력이 비교적 낮기 때문에 많은 수의 마커를 동시에 분석해야 높은 식별력을 얻을 수 있다. 패널을 유연하게 확장하여 다수의 SNP 마커를 분석하기 위해 hybrid capture 기반의 target enrichment 방식이 도입되는 추세이다. 현재까지 미량 DNA를 대상으로 SNP의 hybrid capture를 위한 NGS 라이브러리 (library) 생성은 주로 low-input DNA library preparation kits를 사용하여 수행되어왔다. 하지만 기존에 사용하고 있는 방법은 일정 양 이상의 input DNA를 필요로 하며, input DNA의 양이 줄어들수록 라이브러리 complexity가 줄어드는 한계가 있다. 본 연구에서는 이러한 한계를 극복하고 분석 효율을 높이기 위하여 전장 유전체 증폭 (Whole genome amplification, WGA) 방법을 대안으로 제시하고 유용성을 검증하고자 하였다. 이에, 본 연구에서는 4개 인구 집단에 속하는 5명의 남성 시료를 sub-nanogram 수준으로 연속 희석하여 개인 식별에 유용한 136개의 identity-informative SNP에 대한 hybrid capture 기반 NGS 분석을 수행하고, input DNA의 양 감소와 WGA 수행 유무에 따른 NGS 결과를 비교 분석하였다. Genomic DNA (gDNA) 라이브러리와 비교하여 WGA DNA 라이브러리의 경우 input DNA 양 감소에 관계없이 on-target rate, on-SNP rate에서 보다 안정적인 결과를 확보할 수 있었고, genotype recovery rate가 최대 27배까지 상당히 증가함이 확인되었다. 나아가, duplicate rate 비교를 통해 미량 DNA를 대상으로 WGA를 수행하면 라이브러리 complexity가 개선되는 것을 유추해볼 수 있었다. 본 연구에서는 법과학 실무에서 어려움을 겪는 미량 DNA 분석 결과를 개선하는 대안으로 WGA 수행의 효용성을 보여주었다. 본 연구에서 구축한 방법은 현재 사용하고 있는 방법으로는 해결이 어려운 미량 DNA 분석에 적용하여 개인 신원확인 특정율을 높이고 수사 단서 획득에 기여할 것으로 사료된다. 나아가, 본 연구를 기반으로 얻어진 identity-informative SNP에 대한 NGS 결과는 추후 법과학 실무에서 다양하게 활용 가능한 대규모의 forensic SNP 패널로의 확장 전략을 수립하는데 유용하게 활용될 것으로 사료된다.
In general, a sufficient amount of DNA is required to perform multiple genetic analysis. However, DNA extracted from crime scenes is frequently degraded or recovered in low quantities, limiting the scope of subsequent genetic analyses and leading to unreliable results. With the introd...
In general, a sufficient amount of DNA is required to perform multiple genetic analysis. However, DNA extracted from crime scenes is frequently degraded or recovered in low quantities, limiting the scope of subsequent genetic analyses and leading to unreliable results. With the introduction of next generation sequencing (NGS) into forensic genetics, NGS analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) that can be analyzed in a short length has been in progress. Since most SNP markers have two alleles and thus have relatively low discriminating power, so a large number of SNP markers should be analyzed simultaneously to obtain high discriminating power. In order to flexibly expand the panel to analyze multiple SNP markers, hybrid capture-based target enrichment methods are attracting attention in forensic genetics. Until now, preparation of NGS libraries for hybrid capture of SNPs on trace amounts of DNA has been mainly performed using low-input DNA library preparation kits. However, the existing method requires a certain amount of input DNA, and library complexity decreases as the amount of input DNA decreases. In this study, to overcome these limitations and increase analysis efficiency, the whole genome amplification (WGA), which generates sufficient amplified DNA even from a single cell, was proposed as an alternative. Accordingly, we developed a procedure for hybrid capture-based MPS of 136 identityinformative SNPs for serially diluted samples to sub-nanogram levels and compared MPS results of the SNPs between genomic DNA (gDNA) and WGA DNA depending on the amount of input DNA. On-target rate, OnSNP rate, duplicate rate, and genotype recovery rate of target SNPs were investigated. In the case of the WGA DNA library, more stable results were obtained at the on-target rate and on-SNP rate regardless of the decrease in the amount of input DNA, and it was confirmed that the genotype recovery rate was significantly increased up to 27 times compared to the gDNA library. Furthermore, it was possible to infer that library complexity was improved when WGA was performed on trace DNA through comparison of duplicate rates. According to the results of this study, the utility of WGA application was demonstrated in hybrid capture-based NGS analysis targeting trace amounts of DNA. The results of this study suggest that performing WGA can increase the efficiency of hybrid capture-based NGS for low quantities of DNA, a longstanding challenge in forensic practice. Furthermore, the NGS data on identity-informative SNPs obtained through this study will be useful in establishing an expansion strategy to a large-scale forensic SNP panel that can be used in various ways in forensic practice.
In general, a sufficient amount of DNA is required to perform multiple genetic analysis. However, DNA extracted from crime scenes is frequently degraded or recovered in low quantities, limiting the scope of subsequent genetic analyses and leading to unreliable results. With the introduction of next generation sequencing (NGS) into forensic genetics, NGS analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) that can be analyzed in a short length has been in progress. Since most SNP markers have two alleles and thus have relatively low discriminating power, so a large number of SNP markers should be analyzed simultaneously to obtain high discriminating power. In order to flexibly expand the panel to analyze multiple SNP markers, hybrid capture-based target enrichment methods are attracting attention in forensic genetics. Until now, preparation of NGS libraries for hybrid capture of SNPs on trace amounts of DNA has been mainly performed using low-input DNA library preparation kits. However, the existing method requires a certain amount of input DNA, and library complexity decreases as the amount of input DNA decreases. In this study, to overcome these limitations and increase analysis efficiency, the whole genome amplification (WGA), which generates sufficient amplified DNA even from a single cell, was proposed as an alternative. Accordingly, we developed a procedure for hybrid capture-based MPS of 136 identityinformative SNPs for serially diluted samples to sub-nanogram levels and compared MPS results of the SNPs between genomic DNA (gDNA) and WGA DNA depending on the amount of input DNA. On-target rate, OnSNP rate, duplicate rate, and genotype recovery rate of target SNPs were investigated. In the case of the WGA DNA library, more stable results were obtained at the on-target rate and on-SNP rate regardless of the decrease in the amount of input DNA, and it was confirmed that the genotype recovery rate was significantly increased up to 27 times compared to the gDNA library. Furthermore, it was possible to infer that library complexity was improved when WGA was performed on trace DNA through comparison of duplicate rates. According to the results of this study, the utility of WGA application was demonstrated in hybrid capture-based NGS analysis targeting trace amounts of DNA. The results of this study suggest that performing WGA can increase the efficiency of hybrid capture-based NGS for low quantities of DNA, a longstanding challenge in forensic practice. Furthermore, the NGS data on identity-informative SNPs obtained through this study will be useful in establishing an expansion strategy to a large-scale forensic SNP panel that can be used in various ways in forensic practice.
주제어
#미량 DNA 전장 유전체 증폭 혼성화 포획 차세대 염기서열 분석법 단일 염기 다형성 trace amounts of DNA whole genome amplification hybrid capture next-generation sequencing single nucleotide polymorphisms
학위논문 정보
저자
주수민
학위수여기관
연세대학교 대학원
학위구분
국내석사
학과
의과학과
지도교수
신경진
발행연도
2023
총페이지
62장
키워드
미량 DNA 전장 유전체 증폭 혼성화 포획 차세대 염기서열 분석법 단일 염기 다형성 trace amounts of DNA whole genome amplification hybrid capture next-generation sequencing single nucleotide polymorphisms
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.