[학위논문]Melandrii Herba extract attenuates RANKL-induced osteoclast differentiation through NFATc1/c-Fos downregulation and prevents bone loss in OVX-induced postmenopausal osteoporosis rats원문보기
연구배경 및 목적: 골을 흡수하는 파골세포와 골을 형성하는 조골세포에 의해 유지되는 항상성이 깨지면 다양한 골 질환이 유발되는데 이 중 골다공증은 골 양이 감소하여 골절의 위험이 높아지는 전신 골격질환이다. Bisphosphate 및 hormone replacement therapy (...
ABSTRACT IN KOREAN
국문초록
王不留行 물 추출물의 RANKL 유도 파골세포 분화와 난소 절제 흰쥐 골소실에 대한 연구
김민선 경희대학교 대학원 기초한의과학과 지도교수: 이향숙
연구배경 및 목적: 골을 흡수하는 파골세포와 골을 형성하는 조골세포에 의해 유지되는 항상성이 깨지면 다양한 골 질환이 유발되는데 이 중 골다공증은 골 양이 감소하여 골절의 위험이 높아지는 전신 골격질환이다. Bisphosphate 및 hormone replacement therapy (HRT)는 골다공증 치료를 위해 가장 많이 사용되고 있지만 장기간 투여 시, 심각한 부작용이 발생하기 때문에 부작용이 적고 골다공증 예방 및 치료에 효과적인 새로운 치료제 개발이 필요한 실정이다. 왕불유행(王不留行)은 석죽과의 장구채 Melandrium firmum Rohrbach의 열매가 익었을 때의 지상부를 사용하며 여성질환에 주로 사용되어 왔지만 폐경기 골다공증에 대해서는 연구된 바가 없다. 따라서 왕불유행이 파골세포 분화 및 폐경기 골다공증 모델에 미치는 영향을 확인했다. 방법: In vitro실험에서 파골세포 유도제로 알려진 RANKL (100 ng/ml)과 왕불유행 물 추출물을 RAW 264.7 세포에 처리하여 파골세포 분화를 유도한 뒤 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색을 통하여 왕불유행이 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 또한, F-actin ring과 pit assay를 통하여 왕불유행이 파골세포 골격 형성 및 골 흡수에 미치는 영향을 확인하였다. 그리고, 파골세포 전사인자인 nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic-1 (NFATc1), c-Fos을 western blot과 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통하여 단백질과 유전자 발현 농도를 측정하였다. 또한 파골세포 분화관련 유전자들 중 골 흡수와 관련된 유전자인 matrix metallopeptidase 9 (MMP-9), cathepsin K (CTK), carbonic anhydrase II (CA2) 그리고 TRAP의 발현과, 골격형성관련 인자인 ATPase H+ transporting V0 Subunit D2 (ATP6v0d2), dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP)의 발현 그리고 파골세포 분화 보조인자인 OSCAR, c-src 그리고 B lymphocyte-induced maturation protein-1 (Blimp-1)의 발현을 RT-PCR을 통해 유전자의 발현 정도를 측정하였다. In vivo실험에서, Sprague-Dawley 흰쥐의 난소를 적출하여 폐경기 골다공증 유사 모델을 이용하여 왕불유행 물 추출물을 8주간 투약 후, 대퇴골을 채취하여 micro-computed tomography (micro-CT)을 촬영했다. 골 형성지표에서 왕불유행이 미치는 영향을 확인하기 위해 혈청 내 골 형성지표인 alkaline phosphatase (ALP)를 측정했다.
결과: In vitro 에서 왕불유행 물 추출물은 다핵의 파골세포의 크기 및 숫자 그리고 활성을 억제하였으며, 파골세포 분화에 있어 필수적인 F-actin ring 형성과 osteo-coated plate에서의 골 흡수능을 억제하였다. 왕불유행 물 추출물은 파골세포 분화의 필수 전사인자인 NFATc1과 c-Fos의 단백질 및 유전자 발현을 모두 억제하였다. 또한, 왕불유행 물 추출물은 파골세포 분화 관련 유전자 중 골 흡수관련 인자인 MMP-9, CTK, CA2 그리고 TRAP의 발현을 억제하였고, 파골세포 골격형성관련 인자인 ATP6v0d2와 DC-STAMP, 파골세포 분화 보조인자인 OSCAR, c-Src 그리고 Blimp-1의 발현을 모두 억제하였다. In vivo 에서 왕불유행 저농도 투약군은 폐경기 유사 골다공증 모델에서 난소를 적출한 대조군에 비해 골밀도를 유의하게 증가시켰으며, 혈청 내 ALP의 발현 또한 난소를 적출한 대조군에 비해 왕불유행 저농도 투약군이 유의하게 억제시켰다. 결론: 왕불유행은 골다공증 유사 증상을 완화시키는데 기여할 수 있으며, 이러한 결과는 골다공증 예방 및 치료를 위한 치료제로서의 가능성을 시사한다.
ABSTRACT IN KOREAN
국문초록
王不留行 물 추출물의 RANKL 유도 파골세포 분화와 난소 절제 흰쥐 골소실에 대한 연구
김민선 경희대학교 대학원 기초한의과학과 지도교수: 이향숙
연구배경 및 목적: 골을 흡수하는 파골세포와 골을 형성하는 조골세포에 의해 유지되는 항상성이 깨지면 다양한 골 질환이 유발되는데 이 중 골다공증은 골 양이 감소하여 골절의 위험이 높아지는 전신 골격질환이다. Bisphosphate 및 hormone replacement therapy (HRT)는 골다공증 치료를 위해 가장 많이 사용되고 있지만 장기간 투여 시, 심각한 부작용이 발생하기 때문에 부작용이 적고 골다공증 예방 및 치료에 효과적인 새로운 치료제 개발이 필요한 실정이다. 왕불유행(王不留行)은 석죽과의 장구채 Melandrium firmum Rohrbach의 열매가 익었을 때의 지상부를 사용하며 여성질환에 주로 사용되어 왔지만 폐경기 골다공증에 대해서는 연구된 바가 없다. 따라서 왕불유행이 파골세포 분화 및 폐경기 골다공증 모델에 미치는 영향을 확인했다. 방법: In vitro실험에서 파골세포 유도제로 알려진 RANKL (100 ng/ml)과 왕불유행 물 추출물을 RAW 264.7 세포에 처리하여 파골세포 분화를 유도한 뒤 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색을 통하여 왕불유행이 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다. 또한, F-actin ring과 pit assay를 통하여 왕불유행이 파골세포 골격 형성 및 골 흡수에 미치는 영향을 확인하였다. 그리고, 파골세포 전사인자인 nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic-1 (NFATc1), c-Fos을 western blot과 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 통하여 단백질과 유전자 발현 농도를 측정하였다. 또한 파골세포 분화관련 유전자들 중 골 흡수와 관련된 유전자인 matrix metallopeptidase 9 (MMP-9), cathepsin K (CTK), carbonic anhydrase II (CA2) 그리고 TRAP의 발현과, 골격형성관련 인자인 ATPase H+ transporting V0 Subunit D2 (ATP6v0d2), dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP)의 발현 그리고 파골세포 분화 보조인자인 OSCAR, c-src 그리고 B lymphocyte-induced maturation protein-1 (Blimp-1)의 발현을 RT-PCR을 통해 유전자의 발현 정도를 측정하였다. In vivo실험에서, Sprague-Dawley 흰쥐의 난소를 적출하여 폐경기 골다공증 유사 모델을 이용하여 왕불유행 물 추출물을 8주간 투약 후, 대퇴골을 채취하여 micro-computed tomography (micro-CT)을 촬영했다. 골 형성지표에서 왕불유행이 미치는 영향을 확인하기 위해 혈청 내 골 형성지표인 alkaline phosphatase (ALP)를 측정했다.
결과: In vitro 에서 왕불유행 물 추출물은 다핵의 파골세포의 크기 및 숫자 그리고 활성을 억제하였으며, 파골세포 분화에 있어 필수적인 F-actin ring 형성과 osteo-coated plate에서의 골 흡수능을 억제하였다. 왕불유행 물 추출물은 파골세포 분화의 필수 전사인자인 NFATc1과 c-Fos의 단백질 및 유전자 발현을 모두 억제하였다. 또한, 왕불유행 물 추출물은 파골세포 분화 관련 유전자 중 골 흡수관련 인자인 MMP-9, CTK, CA2 그리고 TRAP의 발현을 억제하였고, 파골세포 골격형성관련 인자인 ATP6v0d2와 DC-STAMP, 파골세포 분화 보조인자인 OSCAR, c-Src 그리고 Blimp-1의 발현을 모두 억제하였다. In vivo 에서 왕불유행 저농도 투약군은 폐경기 유사 골다공증 모델에서 난소를 적출한 대조군에 비해 골밀도를 유의하게 증가시켰으며, 혈청 내 ALP의 발현 또한 난소를 적출한 대조군에 비해 왕불유행 저농도 투약군이 유의하게 억제시켰다. 결론: 왕불유행은 골다공증 유사 증상을 완화시키는데 기여할 수 있으며, 이러한 결과는 골다공증 예방 및 치료를 위한 치료제로서의 가능성을 시사한다.
Introduction: Osteoporosis is a systemic skeletal disease characterized by reduced bone density, which leads to enhance the risk of fracture. As it is recognized as a public health problem, attention has increased worldwide. Bone homeostasis is associated with maintenance of the balance between bone...
Introduction: Osteoporosis is a systemic skeletal disease characterized by reduced bone density, which leads to enhance the risk of fracture. As it is recognized as a public health problem, attention has increased worldwide. Bone homeostasis is associated with maintenance of the balance between bone resorption osteoclasts and bone formation osteoblasts. The increase of the osteoclast numbers and activity can lead to an imbalance of the bone remodeling. These results cause osteoclast-mediated bone diseases such as rheumatoid arthritis, periodontal disease, Paget's disease and osteoporosis. Bisphosphonate and hormone replacement therapy (HRT) with estrogen are one of the most widely used postmenopausal osteoporosis treatments. However, long-term treatment with bisphosphonate is unsuitable in many osteoporosis patients owing to serious side effects. Melandrii Herba (MH), "Wangbulryuhaeng” in Korean, is the dried aerial part from Melandrii Herba Rohrbach, a member of Caryophyllaceae family and has been traditionally used for gynecological conditions. However, the effect of MH on osteoclast differentiation and osteoporosis is yet to be elucidated. Methods: In vitro, RAW 264.7 cells were stimulated with receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) to induced osteoclast differentiation. To evaluate the effect of MH on osteoclast differentiation, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining, actin ring formation and bone resorption assay were conducted. Also, the RANKL-induced expression of NFATc1 and c-Fos were measured using western blot and RT-PCR. I also studied the effect of MH on osteoclast-related genes. To further investigate the anti-osteoporosis effects of MH in vivo, an OVX-induced menopausal osteoporosis rat model was used in this study. Oral administration of MH was done every morning and all animals were sacrificed at 8 weeks after OVX. Femoral head was scanned by micro-computed tomography (micro-CT). Results: TRAP staining showed that TRAP-positive multinucleated giant cells were inhibited by MH treatment. Consistent with the result of TRAP staining, MH decreased TRAP activity in the differentiation medium. MH treatment reduced the actin ring and bone area in a dose-dependent manner. MH decreased protein and mRNA levels of NFATc1 and c-Fos. MH inhibited the RANKL-induced increase of mRNA levels of osteoclast-specific genes such as matrix metallopeptidase 9 (MMP-9), cathepsin k (CTK), carbonic anhydrase 2 (CA2), tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), ATPase Htransporting V0 Subunit D2 (ATP6v0d2), dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP), osteoclast-associated receptor (OSCAR), c-Src and B lymphocyte-induced maturation protein-1 (Blimp-1) in a dose-dependent manner. In OVX-induced rat models, oral administration of low dose MH prevented OVX-induced bone loss and improved bone microarchitecture quality. Low dose MH group had a decreased serum levels of alkaline phosphatase (ALP). Conclusion: In summary, MH may contribute to alleviate osteoporosis-like symptoms without side effects of estrogen. These results suggest that MH may have a potential for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Keywords: Osteoclast, RANKL, Melandrii Herba, NFATc1, c-Fos, ovariectomized
Introduction: Osteoporosis is a systemic skeletal disease characterized by reduced bone density, which leads to enhance the risk of fracture. As it is recognized as a public health problem, attention has increased worldwide. Bone homeostasis is associated with maintenance of the balance between bone resorption osteoclasts and bone formation osteoblasts. The increase of the osteoclast numbers and activity can lead to an imbalance of the bone remodeling. These results cause osteoclast-mediated bone diseases such as rheumatoid arthritis, periodontal disease, Paget's disease and osteoporosis. Bisphosphonate and hormone replacement therapy (HRT) with estrogen are one of the most widely used postmenopausal osteoporosis treatments. However, long-term treatment with bisphosphonate is unsuitable in many osteoporosis patients owing to serious side effects. Melandrii Herba (MH), "Wangbulryuhaeng” in Korean, is the dried aerial part from Melandrii Herba Rohrbach, a member of Caryophyllaceae family and has been traditionally used for gynecological conditions. However, the effect of MH on osteoclast differentiation and osteoporosis is yet to be elucidated. Methods: In vitro, RAW 264.7 cells were stimulated with receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) to induced osteoclast differentiation. To evaluate the effect of MH on osteoclast differentiation, tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining, actin ring formation and bone resorption assay were conducted. Also, the RANKL-induced expression of NFATc1 and c-Fos were measured using western blot and RT-PCR. I also studied the effect of MH on osteoclast-related genes. To further investigate the anti-osteoporosis effects of MH in vivo, an OVX-induced menopausal osteoporosis rat model was used in this study. Oral administration of MH was done every morning and all animals were sacrificed at 8 weeks after OVX. Femoral head was scanned by micro-computed tomography (micro-CT). Results: TRAP staining showed that TRAP-positive multinucleated giant cells were inhibited by MH treatment. Consistent with the result of TRAP staining, MH decreased TRAP activity in the differentiation medium. MH treatment reduced the actin ring and bone area in a dose-dependent manner. MH decreased protein and mRNA levels of NFATc1 and c-Fos. MH inhibited the RANKL-induced increase of mRNA levels of osteoclast-specific genes such as matrix metallopeptidase 9 (MMP-9), cathepsin k (CTK), carbonic anhydrase 2 (CA2), tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), ATPase Htransporting V0 Subunit D2 (ATP6v0d2), dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP), osteoclast-associated receptor (OSCAR), c-Src and B lymphocyte-induced maturation protein-1 (Blimp-1) in a dose-dependent manner. In OVX-induced rat models, oral administration of low dose MH prevented OVX-induced bone loss and improved bone microarchitecture quality. Low dose MH group had a decreased serum levels of alkaline phosphatase (ALP). Conclusion: In summary, MH may contribute to alleviate osteoporosis-like symptoms without side effects of estrogen. These results suggest that MH may have a potential for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Keywords: Osteoclast, RANKL, Melandrii Herba, NFATc1, c-Fos, ovariectomized
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