아플라톡신 (aflatoxins)은 인간과 동물에게 심각한 보건 문제를 일으키는 곰팡이 유래 이차 대사산물이다. 전통주의 발효제로 사용되는 누룩은 자연발효를 거치면서 다양한 미생물이 누룩 내에 생육하는데 이때 아플라톡신을 생성하는 곰팡이에 오염되기도 한다. 누룩에서 아플라톡신을 생성하는 곰팡이는 ...
아플라톡신 (aflatoxins)은 인간과 동물에게 심각한 보건 문제를 일으키는 곰팡이 유래 이차 대사산물이다. 전통주의 발효제로 사용되는 누룩은 자연발효를 거치면서 다양한 미생물이 누룩 내에 생육하는데 이때 아플라톡신을 생성하는 곰팡이에 오염되기도 한다. 누룩에서 아플라톡신을 생성하는 곰팡이는 Aspergillus flavus로 유용 양조미생물인 Aspergillus oryzae와 구분하기 어렵기 때문에, 아플라톡신은 주류의 안전 측면에서 항상 고려되고 있는 사항이다. 따라서 본 연구는 아플라톡신에 대한 전통주의 안전성 확보하고자, 아플라톡신 미검출 누룩에서 유산균의 상대적 함량이 높았다는 관찰을 기반으로, 유산균을 활용하여 누룩 내 A. flavus의 생육과 아플라톡신 생성을 억제하는 방안을 연구하였다. 이를 위하여 누룩 유래 항진균 유산균을 선발하였고, 이들의 아플라톡신 저감 기작을 대사체 및 유전체학 방법으로 분석하여 식품 내 아플라톡신 저감을 위한 생물학적 제제로 사용될 가능성을 확인하였다. LC-MS/MS 분석 결과 총 58종의 누룩 중 10종에서 0.5~76.1 μg/kg의 총 아플라톡신이 검출되었고, 이 중 4종의 총 아플라톡신 함량이 식물성 원료의 허용기준인 15 μg/kg을 초과하였다. 누룩의 아플라톡신 생성원은 A. flavus이었고 아플라톡신 B1이 주요한 유형으로 확인되었다. 누룩의 아플라톡신은 탁주의 양조 특성 (알코올 함량, 당도, 총산, pH)에 영향을 주지 않았으며, 일부 탁주에서만 미량의 아플라톡신이 검출되었다 (아플라톡신 G1, 0.3 μg/kg). 아플라톡신이 검출된 탁주의 미생물 군집분석 결과에서 Saccharomyces cerevisiae의 함량은 상대적으로 낮은 반면 Aspergillus와 Rhizopus의 함량은 높았고, 이를 통해 A. flavus의 기회 감염에 의한 탁주의 아플라톡신 오염 가능성을 확인하였다. 누룩 유래 항진균성 유산균을 확보하기 위하여 179개의 세균 집락을 누룩에서 분리하였고, in vitro 항진균성 실험과 16S 서열 분석 결과를 기반으로 아플라톡신 저감 유산균 10균주와 비저감 유산균 13균주를 선발하여 이들의 대사체 변화를 LC-MS/MS 기반의 비표적 대사체학 방법으로 분석하였다. 아플라톡신 생성 억제력이 우수한 유산균은 Pediococcus pentosaceus, Weissella paramesenteroides, Lactobacillus crustorum에 속하는 7균주였으며, 이들은 A. flavus 생육 억제, 아플라톡신 생성 억제, 아플라톡신 결합으로 배양액 내 아플라톡신 함량을 감소시켰다. 한편 단백질 분해효소인 proteinase K를 처리한 유산균 배양액에서 아플라톡신 생성 억제력이 감소하여, 이를 토대로 유산균이 항진균성 단백질을 생산하여 A. flavus의 생육과 아플라톡신 생성을 억제할 가능성을 확인하였다. 아플라톡신 생성 억제력이 우수한 유산균의 특이적 대사체는 OPLS-DA, 라이브러리와 표준 물질의 MS/MS spectra 비교를 통해 분석하였다. 이 중 A. flavus의 생육과 아플라톡신 생성을 억제하는 lactic acid와 4-hydroxybenzaldehyde (4-HBA)가 확인되었고, 그외 cyclic 2′,3′-adenosine monophosphate (2′,3′-cAMP)–adenosine 경로와 nucleoside 이용 경로에서 아플라톡신 비저감 그룹과 다른 대사체 변화를 보인 2′,3′-cAMP와 adenine이 확인되었다. 아플라톡신 저감 유산균의 특이적 유전자는 P. pentosaceus N19-37과 W. paramesenteroides N44-02를 대상으로 표준균주와의 항진균력 및 전장 유전체 비교를 통해 분석하였다. 그 결과, 세포벽, exopolysaccharides (EPS), capsular polysaccharides의 구성 성분인 deoxythymidine diphophate-L-rhamnose의 합성에 필수적인 4개의 유전자 rmlA, rmlB, rmlC, rmlD가 N19-37의 특이적 유전자로 확인되었고, 이는 polysaccharides가 아플라톡신 결합력에 기여할 가능성으로 제시될 수 있다. 그외 당을 선택적으로 세포질 내로 운송하는 phosphotransferase system (PTS) 관련 유전자가 N19-37과 N44-02의 특이적 유전자로 확인되었고, 이는 같은 환경 내 다른 미생물과의 경쟁에서 N19-37과 N44-02이 우위를 차지할 가능성을 의미한다. 이와 같은 결과를 바탕으로, 누룩 유래 항진균성 유산균은 A. flavus와의 영양성분 경쟁우위, 아플라톡신 생성 억제, 아플라톡신 흡착을 통해 배양배지 내 아플라톡신 함량을 저감하며, 이 과정에 유산균 유래 저분자 대사체와 단백질성 물질 및 polysaccharide가 기여하는 것으로 사료되었다. 본 연구는 유산균을 사용하여 전통누룩의 아플라톡신 저감 가능성을 확인한 첫 연구이며, 아플라톡신에 대한 전통주의 안전성을 발효제인 누룩에서부터 최종 제품인 탁주까지, 주류 전 제조공정에서 연구하였다는 것에 의의가 있다. 전통누룩의 아플라톡신 오염과 원인 균주를 확인하였고, 유전체학 및 대사체학 통합 연구로 아플라톡신 저감 유산균의 특이적 마커분석을 통해 유산균의 아플라톡신 기작을 규명하였다. 본 연구의 결과는 누룩 유래 유산균이 아플라톡신 저감을 위한 생물학적 제제로 활용되기 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.
아플라톡신 (aflatoxins)은 인간과 동물에게 심각한 보건 문제를 일으키는 곰팡이 유래 이차 대사산물이다. 전통주의 발효제로 사용되는 누룩은 자연발효를 거치면서 다양한 미생물이 누룩 내에 생육하는데 이때 아플라톡신을 생성하는 곰팡이에 오염되기도 한다. 누룩에서 아플라톡신을 생성하는 곰팡이는 Aspergillus flavus로 유용 양조미생물인 Aspergillus oryzae와 구분하기 어렵기 때문에, 아플라톡신은 주류의 안전 측면에서 항상 고려되고 있는 사항이다. 따라서 본 연구는 아플라톡신에 대한 전통주의 안전성 확보하고자, 아플라톡신 미검출 누룩에서 유산균의 상대적 함량이 높았다는 관찰을 기반으로, 유산균을 활용하여 누룩 내 A. flavus의 생육과 아플라톡신 생성을 억제하는 방안을 연구하였다. 이를 위하여 누룩 유래 항진균 유산균을 선발하였고, 이들의 아플라톡신 저감 기작을 대사체 및 유전체학 방법으로 분석하여 식품 내 아플라톡신 저감을 위한 생물학적 제제로 사용될 가능성을 확인하였다. LC-MS/MS 분석 결과 총 58종의 누룩 중 10종에서 0.5~76.1 μg/kg의 총 아플라톡신이 검출되었고, 이 중 4종의 총 아플라톡신 함량이 식물성 원료의 허용기준인 15 μg/kg을 초과하였다. 누룩의 아플라톡신 생성원은 A. flavus이었고 아플라톡신 B1이 주요한 유형으로 확인되었다. 누룩의 아플라톡신은 탁주의 양조 특성 (알코올 함량, 당도, 총산, pH)에 영향을 주지 않았으며, 일부 탁주에서만 미량의 아플라톡신이 검출되었다 (아플라톡신 G1, 0.3 μg/kg). 아플라톡신이 검출된 탁주의 미생물 군집분석 결과에서 Saccharomyces cerevisiae의 함량은 상대적으로 낮은 반면 Aspergillus와 Rhizopus의 함량은 높았고, 이를 통해 A. flavus의 기회 감염에 의한 탁주의 아플라톡신 오염 가능성을 확인하였다. 누룩 유래 항진균성 유산균을 확보하기 위하여 179개의 세균 집락을 누룩에서 분리하였고, in vitro 항진균성 실험과 16S 서열 분석 결과를 기반으로 아플라톡신 저감 유산균 10균주와 비저감 유산균 13균주를 선발하여 이들의 대사체 변화를 LC-MS/MS 기반의 비표적 대사체학 방법으로 분석하였다. 아플라톡신 생성 억제력이 우수한 유산균은 Pediococcus pentosaceus, Weissella paramesenteroides, Lactobacillus crustorum에 속하는 7균주였으며, 이들은 A. flavus 생육 억제, 아플라톡신 생성 억제, 아플라톡신 결합으로 배양액 내 아플라톡신 함량을 감소시켰다. 한편 단백질 분해효소인 proteinase K를 처리한 유산균 배양액에서 아플라톡신 생성 억제력이 감소하여, 이를 토대로 유산균이 항진균성 단백질을 생산하여 A. flavus의 생육과 아플라톡신 생성을 억제할 가능성을 확인하였다. 아플라톡신 생성 억제력이 우수한 유산균의 특이적 대사체는 OPLS-DA, 라이브러리와 표준 물질의 MS/MS spectra 비교를 통해 분석하였다. 이 중 A. flavus의 생육과 아플라톡신 생성을 억제하는 lactic acid와 4-hydroxybenzaldehyde (4-HBA)가 확인되었고, 그외 cyclic 2′,3′-adenosine monophosphate (2′,3′-cAMP)–adenosine 경로와 nucleoside 이용 경로에서 아플라톡신 비저감 그룹과 다른 대사체 변화를 보인 2′,3′-cAMP와 adenine이 확인되었다. 아플라톡신 저감 유산균의 특이적 유전자는 P. pentosaceus N19-37과 W. paramesenteroides N44-02를 대상으로 표준균주와의 항진균력 및 전장 유전체 비교를 통해 분석하였다. 그 결과, 세포벽, exopolysaccharides (EPS), capsular polysaccharides의 구성 성분인 deoxythymidine diphophate-L-rhamnose의 합성에 필수적인 4개의 유전자 rmlA, rmlB, rmlC, rmlD가 N19-37의 특이적 유전자로 확인되었고, 이는 polysaccharides가 아플라톡신 결합력에 기여할 가능성으로 제시될 수 있다. 그외 당을 선택적으로 세포질 내로 운송하는 phosphotransferase system (PTS) 관련 유전자가 N19-37과 N44-02의 특이적 유전자로 확인되었고, 이는 같은 환경 내 다른 미생물과의 경쟁에서 N19-37과 N44-02이 우위를 차지할 가능성을 의미한다. 이와 같은 결과를 바탕으로, 누룩 유래 항진균성 유산균은 A. flavus와의 영양성분 경쟁우위, 아플라톡신 생성 억제, 아플라톡신 흡착을 통해 배양배지 내 아플라톡신 함량을 저감하며, 이 과정에 유산균 유래 저분자 대사체와 단백질성 물질 및 polysaccharide가 기여하는 것으로 사료되었다. 본 연구는 유산균을 사용하여 전통누룩의 아플라톡신 저감 가능성을 확인한 첫 연구이며, 아플라톡신에 대한 전통주의 안전성을 발효제인 누룩에서부터 최종 제품인 탁주까지, 주류 전 제조공정에서 연구하였다는 것에 의의가 있다. 전통누룩의 아플라톡신 오염과 원인 균주를 확인하였고, 유전체학 및 대사체학 통합 연구로 아플라톡신 저감 유산균의 특이적 마커분석을 통해 유산균의 아플라톡신 기작을 규명하였다. 본 연구의 결과는 누룩 유래 유산균이 아플라톡신 저감을 위한 생물학적 제제로 활용되기 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.
Aflatoxins, a group of mycotoxins, are secondary metabolites mainly produced by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus, and cause serious health problems to humans and animals. Given the similar morphologic and genetic features of A. flavus and Aspergillus oryzae, which is dominant fungus sp...
Aflatoxins, a group of mycotoxins, are secondary metabolites mainly produced by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus, and cause serious health problems to humans and animals. Given the similar morphologic and genetic features of A. flavus and Aspergillus oryzae, which is dominant fungus species in Nuruk, aflatoxin (AF) has been considered a hazard regarding the safety of Nuruk-based traditional alcoholic beverages. In this study, based on the accordance that the relative abundance of lactic acid bacteria (LAB) was high in non-AF produced Nuruk, the potential use of LAB to reduce the AF content in Nuruk and their AF reduction mechanisms were comprehensively investigated using comparative genomics and metabolomics approaches. Aflatoxins were determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The total aflatoxins content was 0.5–76.1 μg/kg in 10 of 58 Nuruk samples. From the 10 samples, 4 samples exceeded the maximum limits of 15 μg/kg for total aflatoxins in vegetable raw materials. AF B1 was the major type present in Nuruk, and produced by 10 strains of A. flavus. AF in Nuruk did not affect the alcohol content, sugar content, total acidity, and pH of the alcoholic beverages. Trace amounts of AF G1 were detected only in two alcoholic beverages. The relative abundance of Saccharomyces cerevisiae, a predominant species in alcholic beverages, was low in fungal community of the alcoholic beverages with AF G1, whereas that of genera Aspergillus and Rhizopus were high. This finding suggests that AF contamination of alcoholic beverages may occur due to opportunistic infection of A. flavus. To develop antifungal LAB, 179 bacterial colonies were isolated from various traditional Nuruk. A total of 10 and 13 strains of antifungal and non-antifungal LAB, respectively, were selected by in vitro tests and 16S rRNA sequencing. Out of the 10 antifungal LAB strains, the seven strains of Pediococcus pentosaceus, Weissella paramesenteroides, and Lactobacillus crustorum were further selected as antifungal LAB candidates to reduce AF in Nuruk by LC-MS-based non-targeted metabolomics. Selected strains reduced AF content in the medium by inhibiting mycelial growth, inhibiting AF production, and binding AF. In addition, the inhibition of AF production was decreased due to proteinase K, a proteolytic enzyme, which indicates that LAB potentially produce antimicrobial proteins. Furthermore, 9 characteristic marker compounds of the seven AF-reducing LAB strains were selected by orthogonal projections to latent structures discriminant analysis, and identified by comparing mass spectra and retention time against mass spectral library and standard compounds. Among the 9 markers, lactic acid and 4-hydroxybenzaldehyde, which inhibit the growth and AF production by A. flavus, were identified. Additionally, it has been confirmed that the content of cyclic 2′,3′-adenosine monophosphate (2′,3′-cAMP) in the 2′,3′-cAMP–adenosine pathway and adenine in the nucleoside pathway was higher in AF reducing compared to non-reducing LAB. The significant genes involved in AF reduction mechanisms were identified by comparing the antifungal activity and whole genome of P. pentosaceus N19-37 and W. paramesenteroides N44-02 with their type strains. N19-37 had four genes (rmlA, rmlB, rmlC, and rmlD) essential for the synthesis of deoxythymidine diphophate-L-rhamnose, a known component of the LAB cell wall, exopolysaccharides (EPS), or capsular polysaccharides, representing that polysaccharides are expected to contribute to the AF binding capacity of N19-37 due to the AF binding ability of EPS. Genes related to the phosphotransferase system, which selectively transports sugar to the cytoplasm, were also found in the genomes of N19-37 and N44-02. Accordingly, these strains were considered to have a competitive advantage against A. flavus concerning the available nutrients in the surrounding environment. In conclusion, antifungal LAB derived from Nuruk is considered to reduce AF production of A. flavus by followed mechanisms that inhibiting mycelial growth, inhibiting AF production, AF binding affinities, as well as extracellular microbial metabolites, proteinaceous compounds, and polysaccharides, also these might be all regarded to contribute intimately for the antifungal activity. To ensure the safety of traditional alcoholic beverages concerning AFs, this study firstly attempted to reduce the AF levels by Nuruk derived LAB and provide a strategy to prevent AF contamination that can be occurred by aflatoxigenic A. flavus. Noteworthily, the significant effect of LAB on AF content was investigated throughout the overall manufacturing process of alcoholic beverages, from the starter to the final product. This study provides comprehensive genetic and metabolic insights on the inhibitory effects of antifungal LAB isolated from Nuruk. Furthermore, it is addressing that the selected LAB can be applied as a microbial anti-mycotoxigenic agent in foods including Nuruk and alcoholic beverages.
Aflatoxins, a group of mycotoxins, are secondary metabolites mainly produced by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus, and cause serious health problems to humans and animals. Given the similar morphologic and genetic features of A. flavus and Aspergillus oryzae, which is dominant fungus species in Nuruk, aflatoxin (AF) has been considered a hazard regarding the safety of Nuruk-based traditional alcoholic beverages. In this study, based on the accordance that the relative abundance of lactic acid bacteria (LAB) was high in non-AF produced Nuruk, the potential use of LAB to reduce the AF content in Nuruk and their AF reduction mechanisms were comprehensively investigated using comparative genomics and metabolomics approaches. Aflatoxins were determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The total aflatoxins content was 0.5–76.1 μg/kg in 10 of 58 Nuruk samples. From the 10 samples, 4 samples exceeded the maximum limits of 15 μg/kg for total aflatoxins in vegetable raw materials. AF B1 was the major type present in Nuruk, and produced by 10 strains of A. flavus. AF in Nuruk did not affect the alcohol content, sugar content, total acidity, and pH of the alcoholic beverages. Trace amounts of AF G1 were detected only in two alcoholic beverages. The relative abundance of Saccharomyces cerevisiae, a predominant species in alcholic beverages, was low in fungal community of the alcoholic beverages with AF G1, whereas that of genera Aspergillus and Rhizopus were high. This finding suggests that AF contamination of alcoholic beverages may occur due to opportunistic infection of A. flavus. To develop antifungal LAB, 179 bacterial colonies were isolated from various traditional Nuruk. A total of 10 and 13 strains of antifungal and non-antifungal LAB, respectively, were selected by in vitro tests and 16S rRNA sequencing. Out of the 10 antifungal LAB strains, the seven strains of Pediococcus pentosaceus, Weissella paramesenteroides, and Lactobacillus crustorum were further selected as antifungal LAB candidates to reduce AF in Nuruk by LC-MS-based non-targeted metabolomics. Selected strains reduced AF content in the medium by inhibiting mycelial growth, inhibiting AF production, and binding AF. In addition, the inhibition of AF production was decreased due to proteinase K, a proteolytic enzyme, which indicates that LAB potentially produce antimicrobial proteins. Furthermore, 9 characteristic marker compounds of the seven AF-reducing LAB strains were selected by orthogonal projections to latent structures discriminant analysis, and identified by comparing mass spectra and retention time against mass spectral library and standard compounds. Among the 9 markers, lactic acid and 4-hydroxybenzaldehyde, which inhibit the growth and AF production by A. flavus, were identified. Additionally, it has been confirmed that the content of cyclic 2′,3′-adenosine monophosphate (2′,3′-cAMP) in the 2′,3′-cAMP–adenosine pathway and adenine in the nucleoside pathway was higher in AF reducing compared to non-reducing LAB. The significant genes involved in AF reduction mechanisms were identified by comparing the antifungal activity and whole genome of P. pentosaceus N19-37 and W. paramesenteroides N44-02 with their type strains. N19-37 had four genes (rmlA, rmlB, rmlC, and rmlD) essential for the synthesis of deoxythymidine diphophate-L-rhamnose, a known component of the LAB cell wall, exopolysaccharides (EPS), or capsular polysaccharides, representing that polysaccharides are expected to contribute to the AF binding capacity of N19-37 due to the AF binding ability of EPS. Genes related to the phosphotransferase system, which selectively transports sugar to the cytoplasm, were also found in the genomes of N19-37 and N44-02. Accordingly, these strains were considered to have a competitive advantage against A. flavus concerning the available nutrients in the surrounding environment. In conclusion, antifungal LAB derived from Nuruk is considered to reduce AF production of A. flavus by followed mechanisms that inhibiting mycelial growth, inhibiting AF production, AF binding affinities, as well as extracellular microbial metabolites, proteinaceous compounds, and polysaccharides, also these might be all regarded to contribute intimately for the antifungal activity. To ensure the safety of traditional alcoholic beverages concerning AFs, this study firstly attempted to reduce the AF levels by Nuruk derived LAB and provide a strategy to prevent AF contamination that can be occurred by aflatoxigenic A. flavus. Noteworthily, the significant effect of LAB on AF content was investigated throughout the overall manufacturing process of alcoholic beverages, from the starter to the final product. This study provides comprehensive genetic and metabolic insights on the inhibitory effects of antifungal LAB isolated from Nuruk. Furthermore, it is addressing that the selected LAB can be applied as a microbial anti-mycotoxigenic agent in foods including Nuruk and alcoholic beverages.
AI-Helper
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.