[학위논문]시토크롬 P450 효소 CYP184A1, CYP107G1, CYP122A2, CYP2A13의 구조와 기능의 다양성 연구 Structural and Functional Diversity of Cytochrome P450 Enzymes: CYP184A1, CYP107G1, CYP122A2, and CYP2A13원문보기
시토크롬 P450은 다양한 화합물의 산화를 촉매하고 때로 2차 대사 산물의 생합성 경로에 관여한다. Streptomyces는 생물학적으로 다양한 활성 2차 대사물질을 생성한다. S. avermitilis의 게놈에는 33개의 시토크롬 P450 유전자가 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 이들 중 많은 유전자가 2차 대사물질의 생합성에 관여한다. S. avermitilis의 다른 P450의 기능과 구조는 상대적으로 알려지지 않았다. 라파마이신을 생성하는 S. rapamycinicus에서 2개의 P450 유전자, rapN과 rapJ는 라파마이신의 생합성에 관여한다. CYP107G1 (rapN)과 CYP122A2 (rapJ)은 프리라파마이신의 각각 27번과 9번 탄소의 ...
시토크롬 P450은 다양한 화합물의 산화를 촉매하고 때로 2차 대사 산물의 생합성 경로에 관여한다. Streptomyces는 생물학적으로 다양한 활성 2차 대사물질을 생성한다. S. avermitilis의 게놈에는 33개의 시토크롬 P450 유전자가 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 이들 중 많은 유전자가 2차 대사물질의 생합성에 관여한다. S. avermitilis의 다른 P450의 기능과 구조는 상대적으로 알려지지 않았다. 라파마이신을 생성하는 S. rapamycinicus에서 2개의 P450 유전자, rapN과 rapJ는 라파마이신의 생합성에 관여한다. CYP107G1 (rapN)과 CYP122A2 (rapJ)은 프리라파마이신의 각각 27번과 9번 탄소의 산화 반응을 촉매한다. 인간에게서 인간 CYP는 임상적 약물을 포함한 외인성 물질을 촉매한다. CYP2A13 효소는 많은 담배유래 발암 물질의 대사 활성화를 담당하는 주요 효소로 간주한다. 본 연구는 S. avermitilis의 CYP184A1, S. rapamycinicus의 CYP107G1과 CYP122A2, 인간의 CYP2A13 대립유전자 단백질을 순수 분리, 정제하여 이들의 구조적, 기능적 특성을 확립하였다. 2장에서 본인은 S. avermitilis로부터 재조합 CYP184A1 단백질을 발현하여 순수 분리, 정제하였다. 정제된 CYP184A1 단백질은 올레산과 다른 지방산과 결합하였을 때, 특이적인 type Ⅰ 스펙트럼 변화를 보였다. UPLC-MS/MS 분석을 통해 CYP184A1은 9,10-에폭시스테아르산을 생성하기 위해 에폭시화 반응을 유도하였다. CYP184A1과 CYP184A1 올레산 복합체의 결정 구조는 각각 2.3 Å, 1.7 Å의 해상도에서 결정되었다. 전반적인 CYP184A1 구조는 시토크롬 P450의 기본적인 골격을 가지고 있으며 긴 사슬 지방산과 결합하기 위해 요구되는 좁고 깊은 기질 주머니 구조를 갖고 있다. CYP184A1 올레산 복합체의 구조에서 올레산의 C9-C10은 생산적인 에폭시화 반응을 위해 헴에 결합되었다. 본 연구는 Streptomyces에서 지방산의 산화 대사에 대한 P450 효소의 역할을 설명한다. 3장에서 본인은 S. rapamycinicus로부터 재조합 CYP107G1, CYP122A2 단백질을 발현하여 순수 분리, 정제하였다. 두 단백질은 모두 라파마이신, 프리라파마이신, 테스토스테론과 결합하였을 때, 특이적인 type Ⅰ 스펙트럼 변화를 보였다. CYP107G1과 임상적 라파마이신 유도체인 에버롤리무스와의 공결정 복합체의 X-선 결정 구조는 각각 2.9 Å, 3.0 Å의 해상도에서 결정되었다. 전반적인 CYP107G1 구조는 시토크롬 P450의 기본적인 골격을 가지고 있으며 큰 기질 주머니를 가졌다. 헴 그룹의 원위면은 마크로라이드 접근을 수용하기 위해 용매에 노출되었다. 에버롤리무스와 결합한 CYP107G1 복합체의 구조를 기질이 없는 CYP107G1의 구조와 비교하였을 때, 유의한 구조 변화는 관찰되지 않았다. 그러므로, CYP107G1은 부피가 큰 기질을 수용하기 위한 변하기 쉬운 고리를 가진 상대적으로 단단한 구조를 가지고 있다. 에버롤리무스는 압착된 도넛 모양으로 기질 주머니에 결합하였고, 그 길쭉한 구조는 헴 평면과 I-나선에 수직으로 결합되었다. 4장에서 본인은 인간으로부터 5개의 CYP2A13 유전적 변이 (R257C, 133_134insT, R101Q, I331T, R257C/I331T)의 재조합 단백질을 발현하여 순수 분리, 정제하였다. R257C, 133_134insT, I331T, R257C/I331T를 포함한 CYP2A13 돌연변이체는 P450 홀로효소 스펙트럼을 보였으며 야생형보다 낮은 발현량을 보였다. R101Q 돌연변이체는 발현되지 않았다. CYP2A13 돌연변이 단백질들은 쿠마린에 대해 특이적인 type Ⅰ 스펙트럼 변화를 보였으며 돌연변이체의 결합 친화도는 약 3~7배 감소하였다. 4개의 돌연변이 단백질들은 쿠마린과 니코틴 대사에 대해 촉매활성이 감소하였다. R257C/I331T 이중 돌연변이는 증가한 Km 값과 감소한 kcat 값을 보여 결과적으로 촉매 효율이 50% 이상 감소하였다. 133_134insT 돌연변이는 단백질 발현 수준과 촉매 활성 모두 상당히 감소하였다. CYP2A13 대립 유전자 변이체에서 이러한 변이의 기능적 분석은 많은 담배 유래 발암 물질의 생물학적 활성에 대한 CYP2A13 다형성의 결과 이해에 기여한다. 결론적으로, Streptomyces의 CYP184A1, CYP107G1, CYP122A2와 인간의 CYP2A13 대립 유전자 변이체들을 정제하였고 이들의 구조 및 기능적 특성을 확립하였다. 이러한 발견은 P450 효소의 다양한 역할을 설명하고, 산화적 대사 및 이차 대사물질의 복잡한 생합성 경로와 다형성의 결과에 대한 생화학적 통찰력을 제공한다.
시토크롬 P450은 다양한 화합물의 산화를 촉매하고 때로 2차 대사 산물의 생합성 경로에 관여한다. Streptomyces는 생물학적으로 다양한 활성 2차 대사물질을 생성한다. S. avermitilis의 게놈에는 33개의 시토크롬 P450 유전자가 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 이들 중 많은 유전자가 2차 대사물질의 생합성에 관여한다. S. avermitilis의 다른 P450의 기능과 구조는 상대적으로 알려지지 않았다. 라파마이신을 생성하는 S. rapamycinicus에서 2개의 P450 유전자, rapN과 rapJ는 라파마이신의 생합성에 관여한다. CYP107G1 (rapN)과 CYP122A2 (rapJ)은 프리라파마이신의 각각 27번과 9번 탄소의 산화 반응을 촉매한다. 인간에게서 인간 CYP는 임상적 약물을 포함한 외인성 물질을 촉매한다. CYP2A13 효소는 많은 담배유래 발암 물질의 대사 활성화를 담당하는 주요 효소로 간주한다. 본 연구는 S. avermitilis의 CYP184A1, S. rapamycinicus의 CYP107G1과 CYP122A2, 인간의 CYP2A13 대립유전자 단백질을 순수 분리, 정제하여 이들의 구조적, 기능적 특성을 확립하였다. 2장에서 본인은 S. avermitilis로부터 재조합 CYP184A1 단백질을 발현하여 순수 분리, 정제하였다. 정제된 CYP184A1 단백질은 올레산과 다른 지방산과 결합하였을 때, 특이적인 type Ⅰ 스펙트럼 변화를 보였다. UPLC-MS/MS 분석을 통해 CYP184A1은 9,10-에폭시스테아르산을 생성하기 위해 에폭시화 반응을 유도하였다. CYP184A1과 CYP184A1 올레산 복합체의 결정 구조는 각각 2.3 Å, 1.7 Å의 해상도에서 결정되었다. 전반적인 CYP184A1 구조는 시토크롬 P450의 기본적인 골격을 가지고 있으며 긴 사슬 지방산과 결합하기 위해 요구되는 좁고 깊은 기질 주머니 구조를 갖고 있다. CYP184A1 올레산 복합체의 구조에서 올레산의 C9-C10은 생산적인 에폭시화 반응을 위해 헴에 결합되었다. 본 연구는 Streptomyces에서 지방산의 산화 대사에 대한 P450 효소의 역할을 설명한다. 3장에서 본인은 S. rapamycinicus로부터 재조합 CYP107G1, CYP122A2 단백질을 발현하여 순수 분리, 정제하였다. 두 단백질은 모두 라파마이신, 프리라파마이신, 테스토스테론과 결합하였을 때, 특이적인 type Ⅰ 스펙트럼 변화를 보였다. CYP107G1과 임상적 라파마이신 유도체인 에버롤리무스와의 공결정 복합체의 X-선 결정 구조는 각각 2.9 Å, 3.0 Å의 해상도에서 결정되었다. 전반적인 CYP107G1 구조는 시토크롬 P450의 기본적인 골격을 가지고 있으며 큰 기질 주머니를 가졌다. 헴 그룹의 원위면은 마크로라이드 접근을 수용하기 위해 용매에 노출되었다. 에버롤리무스와 결합한 CYP107G1 복합체의 구조를 기질이 없는 CYP107G1의 구조와 비교하였을 때, 유의한 구조 변화는 관찰되지 않았다. 그러므로, CYP107G1은 부피가 큰 기질을 수용하기 위한 변하기 쉬운 고리를 가진 상대적으로 단단한 구조를 가지고 있다. 에버롤리무스는 압착된 도넛 모양으로 기질 주머니에 결합하였고, 그 길쭉한 구조는 헴 평면과 I-나선에 수직으로 결합되었다. 4장에서 본인은 인간으로부터 5개의 CYP2A13 유전적 변이 (R257C, 133_134insT, R101Q, I331T, R257C/I331T)의 재조합 단백질을 발현하여 순수 분리, 정제하였다. R257C, 133_134insT, I331T, R257C/I331T를 포함한 CYP2A13 돌연변이체는 P450 홀로효소 스펙트럼을 보였으며 야생형보다 낮은 발현량을 보였다. R101Q 돌연변이체는 발현되지 않았다. CYP2A13 돌연변이 단백질들은 쿠마린에 대해 특이적인 type Ⅰ 스펙트럼 변화를 보였으며 돌연변이체의 결합 친화도는 약 3~7배 감소하였다. 4개의 돌연변이 단백질들은 쿠마린과 니코틴 대사에 대해 촉매활성이 감소하였다. R257C/I331T 이중 돌연변이는 증가한 Km 값과 감소한 kcat 값을 보여 결과적으로 촉매 효율이 50% 이상 감소하였다. 133_134insT 돌연변이는 단백질 발현 수준과 촉매 활성 모두 상당히 감소하였다. CYP2A13 대립 유전자 변이체에서 이러한 변이의 기능적 분석은 많은 담배 유래 발암 물질의 생물학적 활성에 대한 CYP2A13 다형성의 결과 이해에 기여한다. 결론적으로, Streptomyces의 CYP184A1, CYP107G1, CYP122A2와 인간의 CYP2A13 대립 유전자 변이체들을 정제하였고 이들의 구조 및 기능적 특성을 확립하였다. 이러한 발견은 P450 효소의 다양한 역할을 설명하고, 산화적 대사 및 이차 대사물질의 복잡한 생합성 경로와 다형성의 결과에 대한 생화학적 통찰력을 제공한다.
Cytochrome P450 catalyzes the oxidation of various compounds and is sometimes involved in a biosynthetic pathway in secondary metabolites. Streptomyces spp. produces a variety of biologically active secondary metabolites. The genome of S. avermitilis contains 33 P450 genes and many of which are invo...
Cytochrome P450 catalyzes the oxidation of various compounds and is sometimes involved in a biosynthetic pathway in secondary metabolites. Streptomyces spp. produces a variety of biologically active secondary metabolites. The genome of S. avermitilis contains 33 P450 genes and many of which are involved in the biosynthesis of secondary metabolites. The functions and structures of other P450s in S. avermitilis remain relatively unknown. In S. rapamycinicus producing rapamycin, two P450 genes, rapN and rapJ, are involved in rapamycin biosynthesis. CYP107G1 (rapN) and CYP122A2 (rapJ) catalyze the oxidation reactions of C27 and C9 of pre-rapamycin, respectively. In human, human CYP catalyzes xenobiotic compounds, including clinical drugs. The CYP2A13 enzyme may be considered as the primary enzyme responsible for metabolic activation of many tobacco-specific carcinogens. In this study, CYP184A1 from S. avermitilis, CYP107G1 and CYP122A2 from S. rapamycinicus, and CYP2A13 allelic variants from human were purified, and their structural and functional characterization were identified. In chapter Ⅱ, the recombinant CYP184A1 protein from S. avermitilis has been expressed and purified. The purified CYP184A1 protein displayed the typical type Ⅰ binding spectral changes with oleic acid and other fatty acids. Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis showed that CYP184A1 induced an epoxidation reaction to produce 9,10-epoxystearic acid. The crystal structures of CYP184A1 and CYP184A1 oleic acid complex were determined at 2.3 Å and 1.7 Å resolutions, respectively. The overall CYP184A1 structure adopts the canonical scaffold of cytochrome P450 and possesses a narrow and deep substrate pocket architecture required for binding to linear chain fatty acids. In the structure of the CYP184A1 oleic acid complex, C9-C10 of oleic acid was bound to heme for the productive epoxidation reaction. This study elucidates the roles of P450 enzymes in the oxidative metabolism of fatty acids in Streptomyces species. In chapter Ⅲ, the recombinant proteins of CYP107G1 and CYP122A2 from S. rapamycinicus were expressed and purified. Both proteins displayed the typical type Ⅰ binding spectral changes with rapamycin, pre-rapamycin, and testosterone. The X-ray crystal structures of CYP107G1 and its co-crystal complex with everolimus, a clinical rapamycin derivative, were determined at 2.9 Å and 3.0 Å resolutions, respectively. The overall CYP107G1 structure adopts the canonical scaffold of cytochrome P450 and possesses a large substrate pocket. The distal face of the heme group is exposed to solvents to accommodate macrolide access. When the structure of the everolimus-bound CYP107G1 complex was compared to that of the ligand-free CYP107G1 form, no significant conformational change was observed. Therefore, CYP107G1 has a relatively rigid structure with versatile loops to accommodate a bulky substrate. The everolimus molecule is bound to the substrate-binding pocket in the shape of a squeezed donut, and its elongated structure is bound perpendicular to a planar heme plane and I-helix. In chapter Ⅳ, the recombinant proteins of five CYP2A13 genetic variations (R257C, 133_134insT, R101Q, I331T, and R257C/I331T) from human were expressed and purified. CYP2A13 mutants containing R257C, 133_134insT, I331T, and R257C/I331T displayed P450 holoenzyme spectra. The R101Q mutant was not apparently expressed. CYP2A13 mutant enzymes displayed the typical type Ⅰ spectral changes to coumarin and the binding affinities of mutants were decreased approximately three- to sevenfold. Four mutants displayed reduction of catalytic activities in the metabolism of coumarin and nicotine. The double mutation of R257C/I331T resulted in increased Km values and decreased kcat values, resulting in >50% reduction in catalytic efficiencies. The 133_134insT mutant showed significant decreases in both protein expression level and catalytic activity. Functional analysis of these variations in CYP2A13 allelic variants may help to understand the consequences of CYP2A13 polymorphism in the biological activation of many tobacco-derived carcinogens. In conclusion, CYP184A1, CYP107G1 and CYP122A2 from Streptomyces and CYP2A13 allelic variants from human were purified, and their structural and functional characterizations were identified. These findings may help to elucidate various roles of P450 enzymes and provide biochemical insights in the oxidative metabolism and complicated biosynthetic pathways of secondary metabolism and the consequences of polymorphism.
Cytochrome P450 catalyzes the oxidation of various compounds and is sometimes involved in a biosynthetic pathway in secondary metabolites. Streptomyces spp. produces a variety of biologically active secondary metabolites. The genome of S. avermitilis contains 33 P450 genes and many of which are involved in the biosynthesis of secondary metabolites. The functions and structures of other P450s in S. avermitilis remain relatively unknown. In S. rapamycinicus producing rapamycin, two P450 genes, rapN and rapJ, are involved in rapamycin biosynthesis. CYP107G1 (rapN) and CYP122A2 (rapJ) catalyze the oxidation reactions of C27 and C9 of pre-rapamycin, respectively. In human, human CYP catalyzes xenobiotic compounds, including clinical drugs. The CYP2A13 enzyme may be considered as the primary enzyme responsible for metabolic activation of many tobacco-specific carcinogens. In this study, CYP184A1 from S. avermitilis, CYP107G1 and CYP122A2 from S. rapamycinicus, and CYP2A13 allelic variants from human were purified, and their structural and functional characterization were identified. In chapter Ⅱ, the recombinant CYP184A1 protein from S. avermitilis has been expressed and purified. The purified CYP184A1 protein displayed the typical type Ⅰ binding spectral changes with oleic acid and other fatty acids. Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis showed that CYP184A1 induced an epoxidation reaction to produce 9,10-epoxystearic acid. The crystal structures of CYP184A1 and CYP184A1 oleic acid complex were determined at 2.3 Å and 1.7 Å resolutions, respectively. The overall CYP184A1 structure adopts the canonical scaffold of cytochrome P450 and possesses a narrow and deep substrate pocket architecture required for binding to linear chain fatty acids. In the structure of the CYP184A1 oleic acid complex, C9-C10 of oleic acid was bound to heme for the productive epoxidation reaction. This study elucidates the roles of P450 enzymes in the oxidative metabolism of fatty acids in Streptomyces species. In chapter Ⅲ, the recombinant proteins of CYP107G1 and CYP122A2 from S. rapamycinicus were expressed and purified. Both proteins displayed the typical type Ⅰ binding spectral changes with rapamycin, pre-rapamycin, and testosterone. The X-ray crystal structures of CYP107G1 and its co-crystal complex with everolimus, a clinical rapamycin derivative, were determined at 2.9 Å and 3.0 Å resolutions, respectively. The overall CYP107G1 structure adopts the canonical scaffold of cytochrome P450 and possesses a large substrate pocket. The distal face of the heme group is exposed to solvents to accommodate macrolide access. When the structure of the everolimus-bound CYP107G1 complex was compared to that of the ligand-free CYP107G1 form, no significant conformational change was observed. Therefore, CYP107G1 has a relatively rigid structure with versatile loops to accommodate a bulky substrate. The everolimus molecule is bound to the substrate-binding pocket in the shape of a squeezed donut, and its elongated structure is bound perpendicular to a planar heme plane and I-helix. In chapter Ⅳ, the recombinant proteins of five CYP2A13 genetic variations (R257C, 133_134insT, R101Q, I331T, and R257C/I331T) from human were expressed and purified. CYP2A13 mutants containing R257C, 133_134insT, I331T, and R257C/I331T displayed P450 holoenzyme spectra. The R101Q mutant was not apparently expressed. CYP2A13 mutant enzymes displayed the typical type Ⅰ spectral changes to coumarin and the binding affinities of mutants were decreased approximately three- to sevenfold. Four mutants displayed reduction of catalytic activities in the metabolism of coumarin and nicotine. The double mutation of R257C/I331T resulted in increased Km values and decreased kcat values, resulting in >50% reduction in catalytic efficiencies. The 133_134insT mutant showed significant decreases in both protein expression level and catalytic activity. Functional analysis of these variations in CYP2A13 allelic variants may help to understand the consequences of CYP2A13 polymorphism in the biological activation of many tobacco-derived carcinogens. In conclusion, CYP184A1, CYP107G1 and CYP122A2 from Streptomyces and CYP2A13 allelic variants from human were purified, and their structural and functional characterizations were identified. These findings may help to elucidate various roles of P450 enzymes and provide biochemical insights in the oxidative metabolism and complicated biosynthetic pathways of secondary metabolism and the consequences of polymorphism.
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