크리스퍼유전자가위는 기초생물학 연구에서 유전자치료제에 이르기까지 다양한 방면에서 널리 쓰이는 유전체교정 기술이다. 크리스퍼 캐스12a는 캐스9과 더불어 가장 많이 쓰이는 크리스퍼 플랫폼 중 하나이며, 티민이 풍부한 서열을 프로토스페이서 인접 모티프로 인식한다. 캐스12a는 짧은 44-nt 길이의 가이드 RNA를 사용해 표적 DNA와 20개의 염기쌍을 이루어 표적서열은 인식하고 엇갈린 형태의 가닥 절단을 유도한다. 캐스12a는 캐스9에 비해 불일치된 ...
크리스퍼유전자가위는 기초생물학 연구에서 유전자치료제에 이르기까지 다양한 방면에서 널리 쓰이는 유전체교정 기술이다. 크리스퍼 캐스12a는 캐스9과 더불어 가장 많이 쓰이는 크리스퍼 플랫폼 중 하나이며, 티민이 풍부한 서열을 프로토스페이서 인접 모티프로 인식한다. 캐스12a는 짧은 44-nt 길이의 가이드 RNA를 사용해 표적 DNA와 20개의 염기쌍을 이루어 표적서열은 인식하고 엇갈린 형태의 가닥 절단을 유도한다. 캐스12a는 캐스9에 비해 불일치된 염기에 민감하여, 비표적서열절단이 적고 정확성이 높은 것으로 보고되고 있다. 그러나, 캐스12a 프로토스페이서 인접 모티프에서 먼 부위의 염기불일치 민감도는 상대적으로 떨어지고, 이 부위에 의해 비표적서열 절단효과가 발생할 수 있다. 따라서, 본 연구는 캐스12a의 가이드 RNA에 부분적인 DNA 치환을 도입을 통해서 염기불일치 민감도와 표적특이성의 변화에 대해 연구하였다. 다양한 위치에 DNA 치환이 도입된 가이드 RNA와 캐스12a 를 사용한 절단실험을 통해서 가이드 별 절단효율과 표적 특이성이 분석되었다. 그 결과, 3’ 말단이 8-nt 길이의 DNA로 치환된 키메릭 가이드를 사용하였을 떄, 표적절단효율의 감소없이 비표적절단효과만 감소하는 것이 규명되었다. 키메릭 가이드를 사용한 세포 내 유전자 교정실험의 경우, 전체적인 교정효율이 감소하였지만, 캐스9 닉카아제를 사용하여 유전체의 위상학적 변화를 줄 경우, 교정효율이 다시 회복되었다. 또한, 프로토스페이서 인접 모티프 상호 작용 영역 내 아미노산의 돌연변이의 도입으로 표적인식능력과 교정효율이 강화된 en-캐스12a와 키메릭 가이드를 사용한 유전체 교정을 시도하였다. 그 결과, en-캐스12a와 키메릭 가이드를 사용할 경우, 캐스9 닉카아제의 도움 없이 향상된 효율로 교정이 가능하다는 것을 확인하였다. 또한, 향상된 교정효율에 의해 증가되었던 비표적절단효과가 크게 감소하여 표적특이성이 크게 증가하였다. 본 연구는 키메릭 가이드에 의한 비표적절단효과의 감소를 확인하고, en-캐스12a 와의 키메릭가이드의 사용이 교정효율과 표적특이성을 극대화한다는 것을 규명하였다. 이러한 결과들은 크리스퍼 시스템을 활용한 치료법이나 진단 기술에 있어, 안전성과 정확성의 발전에 도움이 될 것으로 사료된다.
(색인어: 유전체 교정, CRISPR-Cas, 표적특이성, 키메릭 가이드)
크리스퍼 유전자가위는 기초생물학 연구에서 유전자치료제에 이르기까지 다양한 방면에서 널리 쓰이는 유전체교정 기술이다. 크리스퍼 캐스12a는 캐스9과 더불어 가장 많이 쓰이는 크리스퍼 플랫폼 중 하나이며, 티민이 풍부한 서열을 프로토스페이서 인접 모티프로 인식한다. 캐스12a는 짧은 44-nt 길이의 가이드 RNA를 사용해 표적 DNA와 20개의 염기쌍을 이루어 표적서열은 인식하고 엇갈린 형태의 가닥 절단을 유도한다. 캐스12a는 캐스9에 비해 불일치된 염기에 민감하여, 비표적서열절단이 적고 정확성이 높은 것으로 보고되고 있다. 그러나, 캐스12a 프로토스페이서 인접 모티프에서 먼 부위의 염기불일치 민감도는 상대적으로 떨어지고, 이 부위에 의해 비표적서열 절단효과가 발생할 수 있다. 따라서, 본 연구는 캐스12a의 가이드 RNA에 부분적인 DNA 치환을 도입을 통해서 염기불일치 민감도와 표적특이성의 변화에 대해 연구하였다. 다양한 위치에 DNA 치환이 도입된 가이드 RNA와 캐스12a 를 사용한 절단실험을 통해서 가이드 별 절단효율과 표적 특이성이 분석되었다. 그 결과, 3’ 말단이 8-nt 길이의 DNA로 치환된 키메릭 가이드를 사용하였을 떄, 표적절단효율의 감소없이 비표적절단효과만 감소하는 것이 규명되었다. 키메릭 가이드를 사용한 세포 내 유전자 교정실험의 경우, 전체적인 교정효율이 감소하였지만, 캐스9 닉카아제를 사용하여 유전체의 위상학적 변화를 줄 경우, 교정효율이 다시 회복되었다. 또한, 프로토스페이서 인접 모티프 상호 작용 영역 내 아미노산의 돌연변이의 도입으로 표적인식능력과 교정효율이 강화된 en-캐스12a와 키메릭 가이드를 사용한 유전체 교정을 시도하였다. 그 결과, en-캐스12a와 키메릭 가이드를 사용할 경우, 캐스9 닉카아제의 도움 없이 향상된 효율로 교정이 가능하다는 것을 확인하였다. 또한, 향상된 교정효율에 의해 증가되었던 비표적절단효과가 크게 감소하여 표적특이성이 크게 증가하였다. 본 연구는 키메릭 가이드에 의한 비표적절단효과의 감소를 확인하고, en-캐스12a 와의 키메릭가이드의 사용이 교정효율과 표적특이성을 극대화한다는 것을 규명하였다. 이러한 결과들은 크리스퍼 시스템을 활용한 치료법이나 진단 기술에 있어, 안전성과 정확성의 발전에 도움이 될 것으로 사료된다.
The CRISPR-Cas system is a powerful genome editing tool widely used in various fields from basic biology research to gene therapy. CRISPR-Cas12a (also known as Cpf1) is one of the most used CRISPR-effectors along with Cas9, and recognizes thymine-rich sequences as protospacer adjacent motifs (PAMs)....
The CRISPR-Cas system is a powerful genome editing tool widely used in various fields from basic biology research to gene therapy. CRISPR-Cas12a (also known as Cpf1) is one of the most used CRISPR-effectors along with Cas9, and recognizes thymine-rich sequences as protospacer adjacent motifs (PAMs). Cas12a uses a short 44-nt length crRNA to form a duplex with DNA, recognizes a 20bp long target site, and induces a stagger-end double strand break (DSB). Cas12a is known to be more sensitive to mismatch than Cas9, resulting in less off-target cleavage and higher specificity. However, Cas12a has tolerance for mismatches in the PAM-distal region, and there is a possibility of off-target effects. Therefore, in this study, we investigated changes in mismatch tolerance and target specificity by introducing partial DNA substitution into Cas12a crRNA. The cleavage efficiency and target specificity were analyzed by in vitro cleavage experiments using the crRNA of Cas12a with DNA substitution introduced at various positions. As a result, it was revealed that only off-target cleavage was reduced without reducing cleavage efficiency when using crRNA with 8-nt DNA substitution introduced at the 3'-end. In the case of intracellular genome editing using a chimeric guide, the overall efficiency decreased, but it was restored when the genome topology was changed with a nickase combination. We further attempted genome editing using a chimeric DNR-RNA guide for en-AsCas12a, in which target recognition and editing efficiency were enhanced by introducing mutations into residues of the PAM interacting region. As a result, chimeric DNA-RNA guided en-AsCas12a editing showed improved on-target efficiency regardless of nickase combination. In addition, off-target editing, which was increased as much as the improved efficiency, was greatly reduced. In this study, we maximized efficiency and specificity by using a chimeric guide and en-AsCas12a. We believe that these results will contribute to efforts to increase the safety and accuracy of future therapeutic approaches based on the CRISPR-system.
The CRISPR-Cas system is a powerful genome editing tool widely used in various fields from basic biology research to gene therapy. CRISPR-Cas12a (also known as Cpf1) is one of the most used CRISPR-effectors along with Cas9, and recognizes thymine-rich sequences as protospacer adjacent motifs (PAMs). Cas12a uses a short 44-nt length crRNA to form a duplex with DNA, recognizes a 20bp long target site, and induces a stagger-end double strand break (DSB). Cas12a is known to be more sensitive to mismatch than Cas9, resulting in less off-target cleavage and higher specificity. However, Cas12a has tolerance for mismatches in the PAM-distal region, and there is a possibility of off-target effects. Therefore, in this study, we investigated changes in mismatch tolerance and target specificity by introducing partial DNA substitution into Cas12a crRNA. The cleavage efficiency and target specificity were analyzed by in vitro cleavage experiments using the crRNA of Cas12a with DNA substitution introduced at various positions. As a result, it was revealed that only off-target cleavage was reduced without reducing cleavage efficiency when using crRNA with 8-nt DNA substitution introduced at the 3'-end. In the case of intracellular genome editing using a chimeric guide, the overall efficiency decreased, but it was restored when the genome topology was changed with a nickase combination. We further attempted genome editing using a chimeric DNR-RNA guide for en-AsCas12a, in which target recognition and editing efficiency were enhanced by introducing mutations into residues of the PAM interacting region. As a result, chimeric DNA-RNA guided en-AsCas12a editing showed improved on-target efficiency regardless of nickase combination. In addition, off-target editing, which was increased as much as the improved efficiency, was greatly reduced. In this study, we maximized efficiency and specificity by using a chimeric guide and en-AsCas12a. We believe that these results will contribute to efforts to increase the safety and accuracy of future therapeutic approaches based on the CRISPR-system.
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