식물은 다양한 환경스트레스에 노출되어 있고 이러한 상황에서 생존을 위해 수많은 메커니즘을 발달시켜왔다. 인산화 매개 신호 전달은 스트레스에 대한 반응으로 유전자 발현 및 단백질 활성을 조절하는 일반적인 기작이다. 인산기는 카이네이즈에 의해 다른 단백질로 전달될 수 있다. MAP3K는 식물에서 가장 큰 카이네이즈 계열이며, MAPK cascade로 알려진 다양한 그룹과 개별적인 경로로 구성된다. 식물이 환경 스트레스에 노출되면 여러 MAP3K가 카이네이즈 활성을 통해 MAPK cascade 내의 하위 단백질과 ...
식물은 다양한 환경스트레스에 노출되어 있고 이러한 상황에서 생존을 위해 수많은 메커니즘을 발달시켜왔다. 인산화 매개 신호 전달은 스트레스에 대한 반응으로 유전자 발현 및 단백질 활성을 조절하는 일반적인 기작이다. 인산기는 카이네이즈에 의해 다른 단백질로 전달될 수 있다. MAP3K는 식물에서 가장 큰 카이네이즈 계열이며, MAPK cascade로 알려진 다양한 그룹과 개별적인 경로로 구성된다. 식물이 환경 스트레스에 노출되면 여러 MAP3K가 카이네이즈 활성을 통해 MAPK cascade 내의 하위 단백질과 전사인자, 세포골격 단백질, 효소 및 카이네이즈를 인산화하여 양성 또는 음성 조절자로 작용한다. 또한 상위의 카이네이즈 및 포스파테이즈는 인산기를 추가 또는 제거하여 MAP3K를 조절한다. 최근에 다양한 MAP3K가 많은 식물종에서 분리되었으며, 앱시스산과 건조스트레스 조건에서 번역 후 조절자로서 그 기능을 한다고 밝혀졌다. 이 논문에서는 고추의 MAP3K가 앱시스산 핵심 신호전달과 연관되어 앱시스산을 통한 건조스트레스 반응을 조절함을 규명하였다. 첫번째로, BLASTP를 통하여 고추에서 27개의 CaMEKK가 예측되었다. 이 중 14개의 CaMEKK가 계통분석에서 A5그룹에 속하는 걸 확인하였고 이중 9개의 유전자가 ABA와 건조스트레스에서 발현량이 변화하는 것을 정량적 역전사중합효소연쇄반응을 통해 확인하였다. 이 결과는 고추의 MAP3K 유전자가 앱시스산 신호 및 건조 스트레스 반응에 역할을 할 수 있음을 나타낸다. 두번째로, 효모단백질잡종법을 통하여 CaADIP1과 상호작용하는 CaADIK1을 발견하였다. CaADIK1은 세린/트레오닌 카이네이즈 도메인을 가지고 표적단백질의 세린과 트레오닌 잔기를 인산화 시킨다. CaADIK1의 활성은 건조 스트레스상에서 강화되지만 CaADIP1에 의해 억제된다. CaADIK1의 발현을 감소시킨 고추와 과 발현시킨 애기장대 식물의 표현형 분석을 통하여 CaADIK1이 ABA와 건조스트레스 반응에서 양성조절자로 작용함을 확인하였고 CaADIK1의 인산화가 식물의 ABA와 건조스트레스 반응에서 필수적임을 밝혔다. 이러한 결과는 CaADIK1이 ABA를 매개로 한 건조스트레스에서 양성조절자로 작용하며 CaADIP1에 의해 억제됨을 나타낸다. 세번째로, 효모단백질잡종법을 통하여 CaSnRK2.6과 상호작용하는CaMEKK23을 발견하였다. CaMEKK23은 고추의 MEKK중에서 특이적으로 CaSnRK2.6에 의해 인산화 된다. CaMEKK23의 카이네이즈 활성은 CaSnRK2.6을 억제하는 고추 단백질 포스파테이즈 2C들에 의해 억제되는 것이 확인되었다. CaMEKK23의 발현을 감소시킨 고추는 건조스트레스에 민감하고 앱시스산에 둔감한 표현형을 보였으며, 과발현시킨 고추와 애기장대에서는 반대의 표현형을 보였다. 또한 이러한 표현형이 CaMEKK23의 활성을 통해 나타나는 것을 카이네이즈 활성이 없는 CaMEKK23K32N 과발현 애기장대를 통해 확인하였다. CaMEKK23의 발현을 감소시킨 고추에서 나타난 표현형은 고추 단백질 포스파테이즈 2C 중 하나인 CaAITP1과 동시에 발현을 감소시켰을 때, 같은 표현형이 나오는 것을 확인하여, CaMEKK23이 CaAITP1의 하위 단계에서 작용함을 확인하였다. 이러한 결과는 CaMEKK23이 ABA 신호전달과정의 핵심요소인 CaSnRK2.6과 고추 단백질 포스파테이즈 2C들에 의해 인산화 상태가 조절되며, ABA를 매개 로한 건조스트레스에서 양성조절자로 작용함을 나타낸다. 종합적으로 이 논문에서의 결과들은 고추에서 CaMEKK들이 앱시스산을 매개로 한 건조스트레스 반응에 기여하고 고추 단백질 포스파테이즈 2C들 및 CaSnRK2.6에 의해 조절된다는 것을 보여준다.
식물은 다양한 환경스트레스에 노출되어 있고 이러한 상황에서 생존을 위해 수많은 메커니즘을 발달시켜왔다. 인산화 매개 신호 전달은 스트레스에 대한 반응으로 유전자 발현 및 단백질 활성을 조절하는 일반적인 기작이다. 인산기는 카이네이즈에 의해 다른 단백질로 전달될 수 있다. MAP3K는 식물에서 가장 큰 카이네이즈 계열이며, MAPK cascade로 알려진 다양한 그룹과 개별적인 경로로 구성된다. 식물이 환경 스트레스에 노출되면 여러 MAP3K가 카이네이즈 활성을 통해 MAPK cascade 내의 하위 단백질과 전사인자, 세포골격 단백질, 효소 및 카이네이즈를 인산화하여 양성 또는 음성 조절자로 작용한다. 또한 상위의 카이네이즈 및 포스파테이즈는 인산기를 추가 또는 제거하여 MAP3K를 조절한다. 최근에 다양한 MAP3K가 많은 식물종에서 분리되었으며, 앱시스산과 건조스트레스 조건에서 번역 후 조절자로서 그 기능을 한다고 밝혀졌다. 이 논문에서는 고추의 MAP3K가 앱시스산 핵심 신호전달과 연관되어 앱시스산을 통한 건조스트레스 반응을 조절함을 규명하였다. 첫번째로, BLASTP를 통하여 고추에서 27개의 CaMEKK가 예측되었다. 이 중 14개의 CaMEKK가 계통분석에서 A5그룹에 속하는 걸 확인하였고 이중 9개의 유전자가 ABA와 건조스트레스에서 발현량이 변화하는 것을 정량적 역전사 중합효소연쇄반응을 통해 확인하였다. 이 결과는 고추의 MAP3K 유전자가 앱시스산 신호 및 건조 스트레스 반응에 역할을 할 수 있음을 나타낸다. 두번째로, 효모단백질잡종법을 통하여 CaADIP1과 상호작용하는 CaADIK1을 발견하였다. CaADIK1은 세린/트레오닌 카이네이즈 도메인을 가지고 표적단백질의 세린과 트레오닌 잔기를 인산화 시킨다. CaADIK1의 활성은 건조 스트레스상에서 강화되지만 CaADIP1에 의해 억제된다. CaADIK1의 발현을 감소시킨 고추와 과 발현시킨 애기장대 식물의 표현형 분석을 통하여 CaADIK1이 ABA와 건조스트레스 반응에서 양성조절자로 작용함을 확인하였고 CaADIK1의 인산화가 식물의 ABA와 건조스트레스 반응에서 필수적임을 밝혔다. 이러한 결과는 CaADIK1이 ABA를 매개로 한 건조스트레스에서 양성조절자로 작용하며 CaADIP1에 의해 억제됨을 나타낸다. 세번째로, 효모단백질잡종법을 통하여 CaSnRK2.6과 상호작용하는CaMEKK23을 발견하였다. CaMEKK23은 고추의 MEKK중에서 특이적으로 CaSnRK2.6에 의해 인산화 된다. CaMEKK23의 카이네이즈 활성은 CaSnRK2.6을 억제하는 고추 단백질 포스파테이즈 2C들에 의해 억제되는 것이 확인되었다. CaMEKK23의 발현을 감소시킨 고추는 건조스트레스에 민감하고 앱시스산에 둔감한 표현형을 보였으며, 과발현시킨 고추와 애기장대에서는 반대의 표현형을 보였다. 또한 이러한 표현형이 CaMEKK23의 활성을 통해 나타나는 것을 카이네이즈 활성이 없는 CaMEKK23K32N 과발현 애기장대를 통해 확인하였다. CaMEKK23의 발현을 감소시킨 고추에서 나타난 표현형은 고추 단백질 포스파테이즈 2C 중 하나인 CaAITP1과 동시에 발현을 감소시켰을 때, 같은 표현형이 나오는 것을 확인하여, CaMEKK23이 CaAITP1의 하위 단계에서 작용함을 확인하였다. 이러한 결과는 CaMEKK23이 ABA 신호전달과정의 핵심요소인 CaSnRK2.6과 고추 단백질 포스파테이즈 2C들에 의해 인산화 상태가 조절되며, ABA를 매개 로한 건조스트레스에서 양성조절자로 작용함을 나타낸다. 종합적으로 이 논문에서의 결과들은 고추에서 CaMEKK들이 앱시스산을 매개로 한 건조스트레스 반응에 기여하고 고추 단백질 포스파테이즈 2C들 및 CaSnRK2.6에 의해 조절된다는 것을 보여준다.
Plants inevitably face various environmental stresses and have developed numerous mechanisms to survive these challenges. Phosphate-mediated signal transduction is a common method for regulating gene expression and protein activity in response to stresses. Phosphate groups can be transferred to othe...
Plants inevitably face various environmental stresses and have developed numerous mechanisms to survive these challenges. Phosphate-mediated signal transduction is a common method for regulating gene expression and protein activity in response to stresses. Phosphate groups can be transferred to other proteins by proteins called kinases. Mitogen-Activated Protein 3 Kinases (MAP3Ks) are the largest kinase family in plants. They comprise various group and individual pathways that are collectively known as MAPK cascades. When plants encounter environmental stresses, several MAP3Ks act as positive or negative regulators by phosphorylating downstream proteins within the MAPK cascade, as well as transcription factors, cytoskeletal proteins, enzymes, and kinases, through their kinase activity. In addition, other upstream kinases and phosphatases regulate MAP3Ks. Recently, various MAP3Ks have been isolated in many plant species, and evidence suggests that they function as post-translational modulators under various abiotic stresses, including abscisic acid (ABA) responses, drought stresses. In this thesis, I identified that pepper MAP3Ks are associated with ABA core signaling and play a role in modulating ABA-mediated drought stress responses. First, I predicted 27 putative MAP3K genes belonging to the MEKK subfamily (named CaMEKK1-27), based on BLASTP search and in silico analysis. I revealed that 14 CaMEKK genes were clustered into A5 out of the five groups (A1-A5) through phylogenetic analysis. I found that nine genes showed transcriptional regulation by treatment with ABA and drought stress in quantitative reverse-transcription PCR analysis. These nine genes are primarily on chromosomes 2 and 7, and are located close to each other. These results suggest that the pepper MAP3K genes may play a role in ABA signaling and drought stress response. Second, I isolated the pepper protein CaADIK1 (Capsicum annuum CaADIP1 Interaction MAP3 Kinase 1), which interacts with CaADIP1 (Capsicum annuum ABA and Drought-Induced Protein phosphatase 1), through yeast two-hybridization (Y2H) assay. I found that CaADIK1 contains a Serine/Threonine kinase domain, which phosphorylates Serine or Threonine residues of the target proteins. CaADIK1 has the auto kinase activity, which is able to phosphorylate itself. The auto kinase activity of CaADIK1 is enhanced by drought stress, while it is inhibited by CaADIP1. In addition, expression levels of CaADIK1 are induced by ABA, drought, and NaCl treatments. I examined the biological function of this gene using virus-induced gene silencing (VIGS) in pepper plants, generating CaADIK1 overexpressing transgenic Arabidopsis plants. I confirmed that CaADIK1 positively regulates ABA and drought stress response through phenotype analysis. Moreover, I found that kinase activity of CaADIK1 is necessary to regulate stress response using CaADIK1K32N, variant which has no kinase activity, by overexpressing in Arabidopsis plants. These results show that CaADIK1 positively regulates the ABA-dependent drought stress response and is inhibited by CaADIP1. Third, I performed Y2H assay to identify CaMEKK23, which is the pepper MEKK that interacts with CaSnRK2.6. Among pepper MEKKs, I found that CaMEKK23 specifically was phosphorylated by CaSnRK2.6. In addition, kinase activity of CaMEKK23 was inhibited by CaPP2Cs, interacting with CaSnRK2.6. These CaPP2Cs were found to have inhibitory effects on CaSnRK2.6. To reveal the biological function of CaMEKK23 in pepper plant, I compared the phenotype of ABA and drought response using CaMEKK23-silenced pepper, CaMEKK23-OX Arabidopsis, and CaMEKK23-OX pepper plants, along with wild-type plants. CaMEKK23-silenced pepper became be sensitive to drought stress and insensitive to ABA, whereas overexpression of CaMEKK23 in both pepper and Arabidopsis plants exhibited the opposite phenotypes. These altered phenotypes were established to be dependent on kinase activity of CaMEKK23, deduced from the phenotypes of CaMEKK23K32N-OX plants. I revealed that CaMEKK23 and CaSnRK2.6 function downstream of CaAITP1, one of CaPP2Cs, using results from CaMEKK23-, CaAITP1/CaMEKK23-, CaSnRK2.6-, and CaAITP1/CaSnRK2.6-silenced pepper plants. Collectively, my findings demonstrate that CaMEKK23 play a role as a positive regulator in the ABA-mediated drought stress responses in pepper plants, and that its phosphorylation status is modulated by CaSnRK2.6 and CaPP2Cs, functioning as core components of ABA signaling. Taken together, my results indicate that the pepper MAP3Ks contribute to ABA-mediated drought stress response and are modulated as substrates by CaPP2Cs and CaSnRK2.6.
Plants inevitably face various environmental stresses and have developed numerous mechanisms to survive these challenges. Phosphate-mediated signal transduction is a common method for regulating gene expression and protein activity in response to stresses. Phosphate groups can be transferred to other proteins by proteins called kinases. Mitogen-Activated Protein 3 Kinases (MAP3Ks) are the largest kinase family in plants. They comprise various group and individual pathways that are collectively known as MAPK cascades. When plants encounter environmental stresses, several MAP3Ks act as positive or negative regulators by phosphorylating downstream proteins within the MAPK cascade, as well as transcription factors, cytoskeletal proteins, enzymes, and kinases, through their kinase activity. In addition, other upstream kinases and phosphatases regulate MAP3Ks. Recently, various MAP3Ks have been isolated in many plant species, and evidence suggests that they function as post-translational modulators under various abiotic stresses, including abscisic acid (ABA) responses, drought stresses. In this thesis, I identified that pepper MAP3Ks are associated with ABA core signaling and play a role in modulating ABA-mediated drought stress responses. First, I predicted 27 putative MAP3K genes belonging to the MEKK subfamily (named CaMEKK1-27), based on BLASTP search and in silico analysis. I revealed that 14 CaMEKK genes were clustered into A5 out of the five groups (A1-A5) through phylogenetic analysis. I found that nine genes showed transcriptional regulation by treatment with ABA and drought stress in quantitative reverse-transcription PCR analysis. These nine genes are primarily on chromosomes 2 and 7, and are located close to each other. These results suggest that the pepper MAP3K genes may play a role in ABA signaling and drought stress response. Second, I isolated the pepper protein CaADIK1 (Capsicum annuum CaADIP1 Interaction MAP3 Kinase 1), which interacts with CaADIP1 (Capsicum annuum ABA and Drought-Induced Protein phosphatase 1), through yeast two-hybridization (Y2H) assay. I found that CaADIK1 contains a Serine/Threonine kinase domain, which phosphorylates Serine or Threonine residues of the target proteins. CaADIK1 has the auto kinase activity, which is able to phosphorylate itself. The auto kinase activity of CaADIK1 is enhanced by drought stress, while it is inhibited by CaADIP1. In addition, expression levels of CaADIK1 are induced by ABA, drought, and NaCl treatments. I examined the biological function of this gene using virus-induced gene silencing (VIGS) in pepper plants, generating CaADIK1 overexpressing transgenic Arabidopsis plants. I confirmed that CaADIK1 positively regulates ABA and drought stress response through phenotype analysis. Moreover, I found that kinase activity of CaADIK1 is necessary to regulate stress response using CaADIK1K32N, variant which has no kinase activity, by overexpressing in Arabidopsis plants. These results show that CaADIK1 positively regulates the ABA-dependent drought stress response and is inhibited by CaADIP1. Third, I performed Y2H assay to identify CaMEKK23, which is the pepper MEKK that interacts with CaSnRK2.6. Among pepper MEKKs, I found that CaMEKK23 specifically was phosphorylated by CaSnRK2.6. In addition, kinase activity of CaMEKK23 was inhibited by CaPP2Cs, interacting with CaSnRK2.6. These CaPP2Cs were found to have inhibitory effects on CaSnRK2.6. To reveal the biological function of CaMEKK23 in pepper plant, I compared the phenotype of ABA and drought response using CaMEKK23-silenced pepper, CaMEKK23-OX Arabidopsis, and CaMEKK23-OX pepper plants, along with wild-type plants. CaMEKK23-silenced pepper became be sensitive to drought stress and insensitive to ABA, whereas overexpression of CaMEKK23 in both pepper and Arabidopsis plants exhibited the opposite phenotypes. These altered phenotypes were established to be dependent on kinase activity of CaMEKK23, deduced from the phenotypes of CaMEKK23K32N-OX plants. I revealed that CaMEKK23 and CaSnRK2.6 function downstream of CaAITP1, one of CaPP2Cs, using results from CaMEKK23-, CaAITP1/CaMEKK23-, CaSnRK2.6-, and CaAITP1/CaSnRK2.6-silenced pepper plants. Collectively, my findings demonstrate that CaMEKK23 play a role as a positive regulator in the ABA-mediated drought stress responses in pepper plants, and that its phosphorylation status is modulated by CaSnRK2.6 and CaPP2Cs, functioning as core components of ABA signaling. Taken together, my results indicate that the pepper MAP3Ks contribute to ABA-mediated drought stress response and are modulated as substrates by CaPP2Cs and CaSnRK2.6.
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