[학위논문]인간 전분화능 줄기세포 유래 간 모델에서 약물대사 기능에 관여하는 CYP450 유전자의 후성유전조절에 관한 연구 A study on impact of epigenetic modification of CYP450 genes on hepatic drug metabolism in human pluripotent stem cells- derived cell models
시험관 내에서 약물 대사 기능을 구현하는 고기능의 간 세포모델은 신약개발 과정에서 정확한 약물 평가를 위한 체외 모델링에 필수적이다. 간은 인체 내부에서 생성되는 다양한 활성 물질뿐만 아니라 약물과 같은 합성 화합물을 해독하여 체외로 배출시키는 기능을 하는 주요 장기이다. 이 과정에서 약물 또는 중간 대사체의 축적으로 인한 ...
시험관 내에서 약물 대사 기능을 구현하는 고기능의 간 세포모델은 신약개발 과정에서 정확한 약물 평가를 위한 체외 모델링에 필수적이다. 간은 인체 내부에서 생성되는 다양한 활성 물질뿐만 아니라 약물과 같은 합성 화합물을 해독하여 체외로 배출시키는 기능을 하는 주요 장기이다. 이 과정에서 약물 또는 중간 대사체의 축적으로 인한 간 독성은 신약후보물질의 개발 철회 및 시판 약물의 철수의 흔한 원인으로 보고되고 있다. 하지만, 현재까지 인체 간 독성을 정확하게 예측하는 실험 모델은 제한적이다. 현재 전임상 단계에서 주로 간 독성 평가모델로는 실험 동물이 주로 사용되고 있으나, 사람과의 유전형의 차이 등 종간 차이로 인해 인체의 반응성을 완벽히 재현하지 못하는 한계점이 있다. 또한 세포모델로는 인간 일차 간세포가 가장 이상적인 모델로 평가되고 있으나, 제한적인 수급과 세포 공여자 간 약물 반응성 및 생존율 차이와 같은 균질성 확보의 어려움으로 인한 이용이 제한적이다. 이와 비교하여 인간 전분화능 줄기세포는 세포의 공급이 원활하고 분화시킨 간세포는 비교적 균질성이 확보되어 있어 간 독성 연구에 있어 유용한 세포모델로서 평가받고 활용되고 있다. 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포의 기능성과 유용성은 다양한 문헌들에서 보고되고 있으나, 일차 간세포 및 인체 간 조직에 비해 현저히 제한된 약물대사효소 (CYP450)의 발현 및 활성은 여전히 해결해야 할 문제점으로 남아있다. 따라서 본 연구에서는 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포의 억제된 약물대사효소의 발현 조절을 이해하기 위해서 주요 CYP450 유전자의 후성유전학적 조절기전인 DNA 메틸화와 히스톤 단백질 수식을 비교 및 분석하였다. 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포의 CYP450 효소들은 일차 간세포에 비해 전사조절 영역 내 발현 억제 표지인 DNA 과메틸화 및 활성 표지인 히스톤 단백질 수식의 약화에 의해 유전자 발현이 억제되어 있음을 확인하였다. 이를 통해 간세포의 제한된 약물대사효소들의 발현은 후성유전적 조절이 관여하고 있음을 확인하였다. 다시 말해, CYP 유전자 발현의 증가는 세포의 후성유전적 성숙에 중요한 요소이다. 그러므로 배양 방법 및 후성유전 편집과 같은 기술 개발을 통해 CYP 유전자의 발현이 증진된 인간 전분화능 줄기세포 유래 간 모델을 확립할 필요성이 제기되었다. 다음으로, 기존의 2차원 부착 배양 형태의 시험관 내 간세포모델은 체내 복잡한 미세 환경을 모사하기 제한적이기 때문에 간 세포모델의 성숙화를 위해 3차원의 미세 환경을 조성하여 간 오가노이드의 배양 방법을 확립하고, 약물 및 독성 평가 모델로의 활용 가능성을 검증하였다. 우리는 증식과 자가조직화가 가능한 간 내배엽 오가노이드를 생성하였으며, 이를 분화시켜 기존의 간세포보다 성숙한 간 특이적 기능을 보유한 간 오가노이드를 획득하였다. 특히 간의 주요 기능인 해독작용에 중요한 약물대사효소의 발현이 월등히 향상되어 일차 간세포를 대체 할 세포모델로서의 가능성을 시사하였다. 더 나아가, 생물반응기를 사용하여 간 오가노이드를 고도로 성숙화 시키는 배양 방법을 구축하고 이를 검증하였다. 기존의 정적 배양의 오가노이드에 비해 대량 생산이 가능하고 간 기능성 증진을 비롯해 약물대사효소의 발현 및 활성이 향상되어 간 독성 약물에 민감하게 반응하였다. 따라서 이러한 성숙한 오가노이드 모델은 간 독성 관련 약물의 독성을 평가에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 주요단어(Key words): 약물대사, CYP450, 후성유전조절, 인간 전분화능 줄기세포, 간 오가노이드
시험관 내에서 약물 대사 기능을 구현하는 고기능의 간 세포모델은 신약개발 과정에서 정확한 약물 평가를 위한 체외 모델링에 필수적이다. 간은 인체 내부에서 생성되는 다양한 활성 물질뿐만 아니라 약물과 같은 합성 화합물을 해독하여 체외로 배출시키는 기능을 하는 주요 장기이다. 이 과정에서 약물 또는 중간 대사체의 축적으로 인한 간 독성은 신약후보물질의 개발 철회 및 시판 약물의 철수의 흔한 원인으로 보고되고 있다. 하지만, 현재까지 인체 간 독성을 정확하게 예측하는 실험 모델은 제한적이다. 현재 전임상 단계에서 주로 간 독성 평가모델로는 실험 동물이 주로 사용되고 있으나, 사람과의 유전형의 차이 등 종간 차이로 인해 인체의 반응성을 완벽히 재현하지 못하는 한계점이 있다. 또한 세포모델로는 인간 일차 간세포가 가장 이상적인 모델로 평가되고 있으나, 제한적인 수급과 세포 공여자 간 약물 반응성 및 생존율 차이와 같은 균질성 확보의 어려움으로 인한 이용이 제한적이다. 이와 비교하여 인간 전분화능 줄기세포는 세포의 공급이 원활하고 분화시킨 간세포는 비교적 균질성이 확보되어 있어 간 독성 연구에 있어 유용한 세포모델로서 평가받고 활용되고 있다. 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포의 기능성과 유용성은 다양한 문헌들에서 보고되고 있으나, 일차 간세포 및 인체 간 조직에 비해 현저히 제한된 약물대사효소 (CYP450)의 발현 및 활성은 여전히 해결해야 할 문제점으로 남아있다. 따라서 본 연구에서는 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포의 억제된 약물대사효소의 발현 조절을 이해하기 위해서 주요 CYP450 유전자의 후성유전학적 조절기전인 DNA 메틸화와 히스톤 단백질 수식을 비교 및 분석하였다. 인간 전분화능 줄기세포 유래 간세포의 CYP450 효소들은 일차 간세포에 비해 전사조절 영역 내 발현 억제 표지인 DNA 과메틸화 및 활성 표지인 히스톤 단백질 수식의 약화에 의해 유전자 발현이 억제되어 있음을 확인하였다. 이를 통해 간세포의 제한된 약물대사효소들의 발현은 후성유전적 조절이 관여하고 있음을 확인하였다. 다시 말해, CYP 유전자 발현의 증가는 세포의 후성유전적 성숙에 중요한 요소이다. 그러므로 배양 방법 및 후성유전 편집과 같은 기술 개발을 통해 CYP 유전자의 발현이 증진된 인간 전분화능 줄기세포 유래 간 모델을 확립할 필요성이 제기되었다. 다음으로, 기존의 2차원 부착 배양 형태의 시험관 내 간세포모델은 체내 복잡한 미세 환경을 모사하기 제한적이기 때문에 간 세포모델의 성숙화를 위해 3차원의 미세 환경을 조성하여 간 오가노이드의 배양 방법을 확립하고, 약물 및 독성 평가 모델로의 활용 가능성을 검증하였다. 우리는 증식과 자가조직화가 가능한 간 내배엽 오가노이드를 생성하였으며, 이를 분화시켜 기존의 간세포보다 성숙한 간 특이적 기능을 보유한 간 오가노이드를 획득하였다. 특히 간의 주요 기능인 해독작용에 중요한 약물대사효소의 발현이 월등히 향상되어 일차 간세포를 대체 할 세포모델로서의 가능성을 시사하였다. 더 나아가, 생물반응기를 사용하여 간 오가노이드를 고도로 성숙화 시키는 배양 방법을 구축하고 이를 검증하였다. 기존의 정적 배양의 오가노이드에 비해 대량 생산이 가능하고 간 기능성 증진을 비롯해 약물대사효소의 발현 및 활성이 향상되어 간 독성 약물에 민감하게 반응하였다. 따라서 이러한 성숙한 오가노이드 모델은 간 독성 관련 약물의 독성을 평가에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다. 주요단어(Key words): 약물대사, CYP450, 후성유전조절, 인간 전분화능 줄기세포, 간 오가노이드
Human pluripotent stem cell-derived hepatic models, including hepatocytelike cells (hPSC-Heps) and hepatic organoids (HOs), have been considered valuable in vitro models for assessing drug safety evaluation. However, hPSCHeps have limited expression and activity of drug metabolizing enzymes, ...
Human pluripotent stem cell-derived hepatic models, including hepatocytelike cells (hPSC-Heps) and hepatic organoids (HOs), have been considered valuable in vitro models for assessing drug safety evaluation. However, hPSCHeps have limited expression and activity of drug metabolizing enzymes, especially cytochrome P450 (CYP450), which are involved in detoxification, a major function of the liver. Epigenetic mechanisms, including DNA methylation, histone modifications, and microRNA regulation, are essential to control gene expression during stem cell differentiation. First, we identified epigenetic statuses in transcription factor binding sites around regulatory regions and compared them to those of primary human hepatocytes (PHHs). We found that the significantly lower CYP450 gene expression in hPSC-Heps were influenced by DNA hypermethylation in the transcriptional regulatory region and low-level enrichment of H3K27ac histone modification. Next, we generated HOs with enhanced maturity and drug metabolism functions and identified epigenetic regulations of CYP450 gene expression. Overall results suggest that the epigenetic maturity of hPSCderived hepatic models is closely correlated with the expression of CYP450 genes. Next, we established a two-step protocol to generate hepatic endoderm organoids (HEOs) capable of proliferation and self-organization from hPSCs and differentiate them into HOs. In this study, we also developed the HO maturation protocol using a bioreactor without an extracellular matrix (ECM). HOs produced by a bioreactor (bioHOs) can be mass-produced and have guaranteed homogeneity ii compared to static organoids. In particular, the expression and activity of drugmetabolizing enzymes have significantly been improved. Likewise, we verified that epigenetic regulations related to the expression of CYP450 genes were an important factor in the maturity of bioHOs. Ultimately, bioHOs with enhanced drug metabolism were more susceptible to well-known DILI drugs than static HOs, making them suitable as a model for evaluating drug-induced hepatotoxicity. In conclusion, our results suggest the potential for an advanced hepatotoxicity evaluation model by developing epigenetically mature hepatic models with improved drug metabolism. Key words: Drug metabolism, CYP450, Epigenetic modification, Human pluripotent stem cell, Organoids
Human pluripotent stem cell-derived hepatic models, including hepatocytelike cells (hPSC-Heps) and hepatic organoids (HOs), have been considered valuable in vitro models for assessing drug safety evaluation. However, hPSCHeps have limited expression and activity of drug metabolizing enzymes, especially cytochrome P450 (CYP450), which are involved in detoxification, a major function of the liver. Epigenetic mechanisms, including DNA methylation, histone modifications, and microRNA regulation, are essential to control gene expression during stem cell differentiation. First, we identified epigenetic statuses in transcription factor binding sites around regulatory regions and compared them to those of primary human hepatocytes (PHHs). We found that the significantly lower CYP450 gene expression in hPSC-Heps were influenced by DNA hypermethylation in the transcriptional regulatory region and low-level enrichment of H3K27ac histone modification. Next, we generated HOs with enhanced maturity and drug metabolism functions and identified epigenetic regulations of CYP450 gene expression. Overall results suggest that the epigenetic maturity of hPSCderived hepatic models is closely correlated with the expression of CYP450 genes. Next, we established a two-step protocol to generate hepatic endoderm organoids (HEOs) capable of proliferation and self-organization from hPSCs and differentiate them into HOs. In this study, we also developed the HO maturation protocol using a bioreactor without an extracellular matrix (ECM). HOs produced by a bioreactor (bioHOs) can be mass-produced and have guaranteed homogeneity ii compared to static organoids. In particular, the expression and activity of drugmetabolizing enzymes have significantly been improved. Likewise, we verified that epigenetic regulations related to the expression of CYP450 genes were an important factor in the maturity of bioHOs. Ultimately, bioHOs with enhanced drug metabolism were more susceptible to well-known DILI drugs than static HOs, making them suitable as a model for evaluating drug-induced hepatotoxicity. In conclusion, our results suggest the potential for an advanced hepatotoxicity evaluation model by developing epigenetically mature hepatic models with improved drug metabolism. Key words: Drug metabolism, CYP450, Epigenetic modification, Human pluripotent stem cell, Organoids
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