In order to find out hypoglycemic constituents from natural resources, Korean medicinal plants being used for the treatments of diabetes mellitus were tested with streptozotocin-induced diabetic rats. From the above screening, the $CH_2Cl_2$ fraction of 80% methanol extracts of Morus alba...
In order to find out hypoglycemic constituents from natural resources, Korean medicinal plants being used for the treatments of diabetes mellitus were tested with streptozotocin-induced diabetic rats. From the above screening, the $CH_2Cl_2$ fraction of 80% methanol extracts of Morus alba leaves showed hypoglycemic activity. The $CH_2Cl_2$fraction was chromatographed on silica gel, resulting in 9 subfractions, and tested hypoglycemic activity. The subfraction which had a strong hypoglycemic activity was rechromatographed and two galactolipids (compounds 1 and 2) were isolated along with a triterpene (compound 3) from other fractions. On the basis of spectroscopic data, acid hydrolysis, alkaline hydrolysis and enzyme hydrolysis results, compounds 1, 2 and 3 were identified as $1-O-(9Z,12Z,15Z-octatrienoyl)-2-O-(9Z,12Z,15Z-octatrienoyl)-3-O-{\beta}-D-galactopyranosyl$ glycerol, $2(R)-1-O-octadecanoyl-2-O-(9Z,12Z,15Z-octatrienoyl)-3-O-{\beta}-D-galactopyranosyl$ glycerol, and $3{\beta}-hydroxylup-20(29)-ene$ acetate, respectively. Compound 2 (1mg/kg p.o.) has approximately 16% hypoglycemic activity in streptozotocin-induced diabetic rats.
In order to find out hypoglycemic constituents from natural resources, Korean medicinal plants being used for the treatments of diabetes mellitus were tested with streptozotocin-induced diabetic rats. From the above screening, the $CH_2Cl_2$ fraction of 80% methanol extracts of Morus alba leaves showed hypoglycemic activity. The $CH_2Cl_2$fraction was chromatographed on silica gel, resulting in 9 subfractions, and tested hypoglycemic activity. The subfraction which had a strong hypoglycemic activity was rechromatographed and two galactolipids (compounds 1 and 2) were isolated along with a triterpene (compound 3) from other fractions. On the basis of spectroscopic data, acid hydrolysis, alkaline hydrolysis and enzyme hydrolysis results, compounds 1, 2 and 3 were identified as $1-O-(9Z,12Z,15Z-octatrienoyl)-2-O-(9Z,12Z,15Z-octatrienoyl)-3-O-{\beta}-D-galactopyranosyl$ glycerol, $2(R)-1-O-octadecanoyl-2-O-(9Z,12Z,15Z-octatrienoyl)-3-O-{\beta}-D-galactopyranosyl$ glycerol, and $3{\beta}-hydroxylup-20(29)-ene$ acetate, respectively. Compound 2 (1mg/kg p.o.) has approximately 16% hypoglycemic activity in streptozotocin-induced diabetic rats.
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문제 정의
3-4) 상엽 추출물의 혈당강하 작용은 주로 물추출물에 기인한 것으로 보고되었으며 물 추출물로부터 분리된 아미노당 화합물이 혈당강하작용을 나타내는 활성물질로 여겨진다.3 4) 그러나 최근 생약으로부터 혈당강하작용 물질을 탐색하는 연구를 통해 우리는 미숙 상엽의 유기용매 추출물이 현저한 혈당강하작용이 있음을 스트렙토조토신 투여 횐쥐 모델에서 확인하여 이 화합물의 분리를 시도하였으며 활성지향분석법을 통해 활성이 나타난 분획을 추적하여 물질을 분리하던 중 2종류의 당지질을 분리하여 구조를확인하였으며 그 중 한 종류의 당지질이 약하지만 유의성 있는 혈당강하작용을 나타내었기에 결과를보고하고자 한다.
본 연구는 과학기술부의 글리시드산 및 피론계 당뇨병 치료제' 연구비 지원에 의해 수행되었으므로 이에 감사 드린다.
제안 방법
반응시켰다. 2N-HC1 MeOH로 중화한 다음 n-bexane으로 추출하여 GC-MS를 측정하였다. MeOH 부분은 농축하여 MeOH를 이동상으로하여 Sephadex LH-20 chroma-tography와 SPE(solid phase extraction, C18)를 연속으로 실시하여 화합물 2a를 얻었다.
혈장내 glucose 함량은 glucose oxidase법5)에 의하여 측정하였다. Glu-cose를 산화시켜 H2O2와 Glucuronic acid를 형성시키고 peroxidase를 이용하여 여기서 생성된 H2O2와 phenol, 4-aminoantipyrine을 정량적으로 축합시켜 생성된 적색의 물질을 정량하여 glucose의 양을 결정하였으며 다음 식에 따라 계산하였다.
혈당강하작용 측정 - Sprague-Dawley계 횐쥐 수컷을 사용하여 화합물 2 및 각 분획의 혈당 강하 작용을 확인하였다. Streptozotocin의 투여량은 용량에 따른 혈장농도 및 체중에 주는 영향을 검토한 실험에서 가장 완만한 체중감소를 보인 45 mg/kg body weight 농도를 이용하였으며 0.01M의 citrate buffer(pH 4.5)에 streptozotocin 조제액 2 ml/kg를 꼬리 정맥에 주사한 후 안구정맥총에서 capillary# 이용하여 혈액을 취하고, 이를 3000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 혈장을 취하여 혈당을 측정하여 당뇨발생여부을 확인하였다. 실험동물 혈장 중의 포도당의 농도가 300 mg/dl 이상인 동물만 당뇨가 유발된 것으로 판정하고 혈당 강하 작용 검색에 사용하였다.
100℃에서 3시간 reflux 하였다. n-hexane으로 추출하여 GC-MS를 측정하고 MeOH부분은 2N-KOH로 중화 후 농축하고 SIGMA-SIL-A로 TMS화하여 GC로 당 표준품과 비교하였다.
어린 상엽으로부터 혈당강하효과를 나타내는 물질의 추적 분리를 실시하여 2 종류의 galactolipid를 얻었다. 화합물 1 은 1-0X9Z, 12Z, 15Z-octatrie- noyl)-2-O-(9Z, 12Z, 15Z-octatrienoyl)-3-0-p-galac- topyranosyl glycerol, 화합물 2는 2(R)l-O-(octa- decanoyl)-2-O-(9Z, 12Z, 15Z-octatrienoyl)-3-O-P- galactopyranosyl glycerol로 동정하였으며 상엽에서처음 분리 보고되는 물질이다.
D로 표시하였으며 Analysis of Wrience(ANOVA)S. 유의성을 검정하였다. Blood glucose inhibition rate는 다음과 같은 식으로 계산하였다.
최근 생약으로부터 혈당 강하작용물질을 탐색하는 연구를 통해 우리는 미숙 상엽의 CH2CI2 추출물이 30% 정도의 혈당 강하작용이 있음을 스트렙토조토신 투여 흰쥐 모델에서 확인하였다. 이 결과는 기존의 연구가 주로 상엽의 물 추출물에서 혈당강하 작용이 나타났다는 사실을 감안할 때 의미 있는 것으로 판단되어 이 화합물의 분리를 시도하였으며 활성지향 분석법을 통해 활성이 나타난 분획을 추적하여 물질을 분리하던 중 2종류의 당지질을 분리하였다.
g의 MeOH엑스를 얻었다. 이것을 소량의 물에 현탁한 후 CHQm로 분획하여 CH2CI2 가용분획 200 g을 얻었고, 이것을 CHC, 과 acetone, MeOH의 혼합용매를 이동상으로 하여 silica gel column chromatography를 실시하여 9개의 분획을 얻었다. 이들 중 streptozotocin으로 당뇨를 유발한 흰쥐에서 가장 활성이 좋았던 네 번째 분획 (Fr.
이것을 소량의 물에 현탁한 후 CHQm로 분획하여 CH2CI2 가용분획 200 g을 얻었고, 이것을 CHC, 과 acetone, MeOH의 혼합용매를 이동상으로 하여 silica gel column chromatography를 실시하여 9개의 분획을 얻었다. 이들 중 streptozotocin으로 당뇨를 유발한 흰쥐에서 가장 활성이 좋았던 네 번째 분획 (Fr. IV)을 n-hexane과 acetone 혼합용매를 이동상으로 하여 silica gel column chromatography, w-hexane 과 CH2C12, MeOH을 이동상으로 하여 Sephadex LH-20 column chromatography# 연속으로 실시한 후 C18-HPLC (AcCN:H2O = 75 :25)를 실시하여 화합물 1, 2를 얻었다.
혈당강하작용 검색 결과는 시험물질 투여전의 blood glucose level(mg/dl)을 측정한 다음 시험물질을 투여후 7일 후의 blood glucose level(mg/dl)을 측정하여 비교하였다. 각 실험 결과는 mean± S.
9(6'-C).혈당강하작용 측정 - Sprague-Dawley계 횐쥐 수컷을 사용하여 화합물 2 및 각 분획의 혈당 강하 작용을 확인하였다. Streptozotocin의 투여량은 용량에 따른 혈장농도 및 체중에 주는 영향을 검토한 실험에서 가장 완만한 체중감소를 보인 45 mg/kg body weight 농도를 이용하였으며 0.
대상 데이터
5715, Merck), RP-18 F254s(Art. 15685, Merck» 사용호]였으며, TLC 후 anisaldehyde-qSQ 와 a-naphthol 시 약, UV lamp(254 nm)를 사용하여 검출하였다. 식물 추출용과 coulumn chromatography용 용매는 1급 시약을 증류하여 사용하였고, 분석시에는 특급시약을, HPLC시에는 HPLC (EM science)용 용매를 사용하였다.
IR은 Perkin Elmer 1710 spectrometer를 사용하였으며 EI-MS는 VG Trio-2 spectrometer#, FAB-MS는 JMS-AX505WA Mass spectrometerQEOL, Japan)를 사용하여 측정하였다. UV는 Shimadzu 2100 UV-Visible spectrophotome ter, 'H-NMR은 Varian Unity(300 MHz), 33C-NMR 은 Wian Unity(75MHz) 와 JEOL GSX 400(100 MHz)을 사용하였다. Column chromatography resin 으로는 Kiesel gel 60(particle size 40—60 μm, Art.
, Lot 83H0885, Sigma)를 사용하였다. 당의 TMS화 시약으로는 SIGMA-SIL-A(Lot. 113H7852, Sigma)를 사용하였다.
식물 추출용과 coulumn chromatography용 용매는 1급 시약을 증류하여 사용하였고, 분석시에는 특급시약을, HPLC시에는 HPLC (EM science)용 용매를 사용하였다. 산가수분해와 알칼리 가수분해시에는 2N HCl-MeOH 과, 10% NaOMe-MeOH를 각각 사용하였으며, 효소 가수분해시에는 Lipase type Vni(from Pseudomo nas sp., Lot 83H0885, Sigma)를 사용하였다. 당의 TMS화 시약으로는 SIGMA-SIL-A(Lot.
15685, Merck» 사용호]였으며, TLC 후 anisaldehyde-qSQ 와 a-naphthol 시 약, UV lamp(254 nm)를 사용하여 검출하였다. 식물 추출용과 coulumn chromatography용 용매는 1급 시약을 증류하여 사용하였고, 분석시에는 특급시약을, HPLC시에는 HPLC (EM science)용 용매를 사용하였다. 산가수분해와 알칼리 가수분해시에는 2N HCl-MeOH 과, 10% NaOMe-MeOH를 각각 사용하였으며, 효소 가수분해시에는 Lipase type Vni(from Pseudomo nas sp.
5)에 streptozotocin 조제액 2 ml/kg를 꼬리 정맥에 주사한 후 안구정맥총에서 capillary# 이용하여 혈액을 취하고, 이를 3000 rpm에서 15분간 원심분리한 후 혈장을 취하여 혈당을 측정하여 당뇨발생여부을 확인하였다. 실험동물 혈장 중의 포도당의 농도가 300 mg/dl 이상인 동물만 당뇨가 유발된 것으로 판정하고 혈당 강하 작용 검색에 사용하였다. 혈장내 glucose 함량은 glucose oxidase법5)에 의하여 측정하였다.
실험재료 - 실험에 사용한 식물재료는 농촌진흥청 곤충연구부에서 1996년 6월초에 채집한 어린 상엽 (10 kg)을 즉시 짧은 시간동안 열처리한 후 건조 한 것을 세절하여 사용하였다.
데이터처리
각 실험 결과는 mean± S.D로 표시하였으며 Analysis of Wrience(ANOVA)S. 유의성을 검정하였다.
이론/모형
실험동물 혈장 중의 포도당의 농도가 300 mg/dl 이상인 동물만 당뇨가 유발된 것으로 판정하고 혈당 강하 작용 검색에 사용하였다. 혈장내 glucose 함량은 glucose oxidase법5)에 의하여 측정하였다. Glu-cose를 산화시켜 H2O2와 Glucuronic acid를 형성시키고 peroxidase를 이용하여 여기서 생성된 H2O2와 phenol, 4-aminoantipyrine을 정량적으로 축합시켜 생성된 적색의 물질을 정량하여 glucose의 양을 결정하였으며 다음 식에 따라 계산하였다.
성능/효과
(2) 상엽의 혈당 강하 효과는 이미 밝혀진 아미노당의 glucosidase 억제작용*과 더불어 당지질이 혈당 강하효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
0를 나타냄으로 당부분이 β-galactopyranose라는 것을 알 수 있었다.6) 이는 산가수분해 후 TMS화하여 GC로 표준품과 비교하여당 부분이 galactopyranose라는 것을 확인하였다. 또한 3개의 oxygenated carbon(70.
8 ppm)이 나타나 이것이 glycerol moiety라는 것을알 수 있었다. 그리고 fatty acid의 double bond의 geometry는 cis configuration 이라는 것을 확인할수 있었다. 보통 double bond 옆에 위치한 carbon이 δ27~28 ppm에 나타나면 cis-cofiguration이고 δ32—33 ppm에 나타나면 trans-configuration이다.
네 번째 분획 (Fr. IV)에서 분리된 화합물 1, 2의 혈당강하 작용을 측정한 결과(Table II) 화합물 2(1 m以kg p.o.M 약하지만 유의성 있는 활성을 나타내었다.
있는 glycolipid 계열임을 알 수 있었다. 당의 anomeric signals는 'H-NMR spectral data에서 84.25 ppm(d, J=7.56 Hz)에 나타나 당이 β-configuration 이라는 것을 알 수 있었고, 1H-NMR에서 § 104.0, 71.3, 73.5, 69.2, 74.5, 62.0를 나타냄으로 당부분이 β-galactopyranose라는 것을 알 수 있었다.6) 이는 산가수분해 후 TMS화하여 GC로 표준품과 비교하여당 부분이 galactopyranose라는 것을 확인하였다.
이 메틸기가 메틸렌 수소들과 virtual coupling이 적을수록 더 뾰족해지고 downfield shift하기 때문이다. 또한 IR spectral data에서 3350 cm-1(-OH)와, 2950 cm-1(aliphatic), 1475 cm-1(carbonyl)을 확인 할 수 있었다. FAB MS spec-trum에서 797의 [M+Na]+를 얻었으며 10% Na OMe-MeOH 가수분해에 의하여 2개의 acyl moiety가 동일한 methyl linolenate임을 확인하였다.
이것으로 환경이 다른 2개의 methyl기가 존재한다는 것을 알 수 있다. 또한 알칼리 가수분해 시 methyl linolenate(18:3)와 methyl palmitate(16:0)가 존재함을 알 수 있었으며 효소를 이용한 가수분해에서 methyl palmitate(16:0)가 더 많이 분해되는 것을 확인하여 1번 위치에 palmitic acid가 ester 결합하는 것을 알 수 있었다.FAB MS에서 777[M+Na]+를 확인하였고, IR spectrum에서 340K-OH), 2928, 2853(aliphatic), 1733(C=O), 652(C=C), 776를 확인하였다.
9에 나타났다. 이로써 당이 β configuration이라는 것을 알 수 있었으며 산가수분해 후 표준품과 비교하여 P-galactopyranose 임을 확인하였다.6)그러나, 화합물 1 과 달리 1H- NMR에서 methyl기의 위치가 sharp한 triplet(0.
FAB MS spec-trum에서 797의 [M+Na]+를 얻었으며 10% Na OMe-MeOH 가수분해에 의하여 2개의 acyl moiety가 동일한 methyl linolenate임을 확인하였다. 이상의 결과를 바탕으로 화합물 1이 1-O-(9Z, 12Z, 15Z-octatrienoyl)-2-O-(9Z, 12Z, 15Z-octatrie-noyl)-3-O-P-D-galactopyranosyl glycer이임을 확인하였다.
연구 대상이 되어왔다. 최근 생약으로부터 혈당 강하작용물질을 탐색하는 연구를 통해 우리는 미숙 상엽의 CH2CI2 추출물이 30% 정도의 혈당 강하작용이 있음을 스트렙토조토신 투여 흰쥐 모델에서 확인하였다. 이 결과는 기존의 연구가 주로 상엽의 물 추출물에서 혈당강하 작용이 나타났다는 사실을 감안할 때 의미 있는 것으로 판단되어 이 화합물의 분리를 시도하였으며 활성지향 분석법을 통해 활성이 나타난 분획을 추적하여 물질을 분리하던 중 2종류의 당지질을 분리하였다.
화합물 1의 spectral data에서, 이 화합물은 당과 double bond가 있는 aliphatic long chain으로 구성되어 있는 glycolipid 계열임을 알 수 있었다. 당의 anomeric signals는 'H-NMR spectral data에서 84.
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