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문제 정의
- Cyclooxygenase-1 억제효과 -HEL 세포주에서의 COX-1 활성에 대한 검체의 억제 작용 여부를 검토하였다. "C-labelled arachidonic acid의 대사산물을 TLC하여 감광시켰을 때의 결과는 Fig.
- PBQ유발 writhing증상 억제작용 - 앞서 냉수추출물이 나타낸 진통작용의 유효물질 확인을 위하여 각 분획물을 투여하였을 때, PBQ로 유발시킨 writhing 증상을 억제하는지의 여부를 검토하였다. 이 결과는 Table IV에 표시하였는데, 카라기난유발 부종실험의 경우와 마찬가지로 chloroform, ethyl acetate 및 butanol 분획물의 투여시에는 PBQ유발 writhing 증상을 전혀 억제하지 못하였다.
- 이 물분획을 정맥내 투여하였을 때, 소염 및 진통작용을 나타내는 용량인 175 ㎎/㎏ 투여군에서 정상체온에 아무런 영향을 미치지 않음이 확인되었으며, 급성 독성 시험 시, 중간치사량(L %)이 500 ㎎/㎏ 이상으로 나타났다. 그러므로, 백두옹 냉수추출물의 물분획은 소염 및 진통물질로서의 개발을 목표로하여 colunm chromathgraphy에 의한 성분분리를 실시하여 순수물질을 분리할 가치가 있다고 사료되는 바이다.
- 본 연구는 물 추출물을 다시 분획하여 그 분획물에 대한 소염진통작용을 추구한 것이다. 실험 실시에 있어서 전보에서 지적한 바와 같이 중국에서 정맥투여 제제가 소개되어 있으므로2)이 실험에서도 정맥투여로서 효능실험을 실시하였다.
제안 방법
- 즉, 체중 150-160 g의 흰쥐를 하룻밤 절식시킨 뒤, 뒷발의 용적(Vn)을 측정하였다. 1% 카라기난-생리식염액 0.1 ml를 흰쥐 뒷발바닥에 피하주사하고, 일정 시간 간격으로 뒷발의 용적(Vt)을 plethysmometer (Ugo Basile, Varese, Italy)로 측정하였다. 검체는 경구투여시에는 카라기난용액 주사 30분 전에 주입하였고, 정맥내로 투여할 때는 카라기난용액 주사 직전에 꼬리 정맥으로 주입하였다.
- Relabelled prostanoid의 검출을 위해 autoradiography를 수행하였는데 TLC plate를 Fuji BAS-UIs imaging plate에 부착시켜 48시간 동안 두어 감광시켰다.12)BAS-1500 bioimaging analyzer (Fuji Photo Film Co. Ltd., Japan)를 사용하여 prostanoid bands를 정량하였다. 검체의 COX-1 억제 정도는 검체 대신 DMSO만 처리한 대조군의 14C-labelled prostanoid의 양과 비교 (% of control)하였다.
- 1 macrophage를 2X104개/ml가 되도록 희석한 다음, 24 weU plat에 1ml씩 분주하고, 37℃ 의 인큐베이터에서 안정화시켜 cell이 plate 기벽에 잘 부착되도록 하였다. 24시간 후 COX-1의 활성을 배제하기 위하여 aspirin(최종농도 0.4|ig/ml)을 첨가하고, COX-2를 유도하기 위하여LPS (2.5|ig/ml)를 넣은 다음, 각 농도의 검체를 주입하고 상기와 같은 조건의 인큐베이터에 두었다. 4&시간 후에 COX-2 억제 효과를 검토하였다.
- 이 혼합물 200 B에 ethyl acetate 500 B를 넣고 10분 동안 진탕하여 COX 대사산물인 prostanoid를 추출하였다. 25000 g에서 3분간 원심분리하여 ethyl acetate층을 얻어내고 speed vacuum dryer> 이용하여 30분 동안 농축한 다음, 다시 200 B의 ethyl acetate에 녹여 TLC를 실시하였다. 이때, 전개용매는 CHCE-MeOH-HAc-qO (90:10:1:1)를 사용하였고, 실온에서 90분간 전개시켰다.
- 1ml 씩을 꼬리에 정맥주사하였다. 30분 후, 복강 액을 채취하여 3000rpm에서 10분간 원심분리 한 다음, 자외부 흡수스펙트럼하에서 혈관 투과성의 정도를 검정하였다. 검체는 경구투여시에 초산- 생리식염액 투여 30분 전에, 정맥투여시에는 초산-생리식염액 투여 직전에 주입하였다.
- HEL세포주는 37℃, 5% CO2 및 100% 습도가 유지되는 인큐베이터에서 배양하였으며, 배지는 5% fetal bovine serum 및 lOOXanti- bioticantimycotic 용액을 함유한 RPMI 1640 배지를 사용하였다. 3~ 4일간 배양시킨 HEL 세포주를 24-well microtiter plate에 2X106cells/wello] 되도록 분주한 다음, 각 농도의 검체를 처리하여 상기와 같은 조건의 인큐베이터에 두었다. 이때, 검체는 DMSO 에 용해시켰다.
- 5|ig/ml)를 넣은 다음, 각 농도의 검체를 주입하고 상기와 같은 조건의 인큐베이터에 두었다. 4&시간 후에 COX-2 억제 효과를 검토하였다. 이때, COX-2에 대한 검체의 억제 효과의 판정은 COX-1 assay시와 같은 방법으로 하였다.
- 생리식염액 5ml을 공기낭 내에 주입하여 백혈구유주를 유발시켰다. 6시간 후 낭 속의 삼출액을 전액 취해서 계량한 후, 일정 량을 취해서 이중의 백혈구를 Cell-Dyn 3500 (Abbott Co. Ltd., IL, USA)을 이용하여 계수하였다. 삼출액중 단백질의 양은 Bradford의 방법 7'으로 정량하였다.
- Prostaglandin류의 생합성 억제능을 찾기 위해서 ra-diorabelled arachidonic acid를 이용하여 생성된 me-tabolite들을 정량함으로써 억제효과를 검사하였다. Cy-clooxygenase(COX)-l assay에는 human erythroleukemia cell Hne(HEL)을 사용하였으며, Moroney 등11) 의 방법을 사용하였다.
- 이때, 전개용매는 CHCE-MeOH-HAc-qO (90:10:1:1)를 사용하였고, 실온에서 90분간 전개시켰다. Relabelled prostanoid의 검출을 위해 autoradiography를 수행하였는데 TLC plate를 Fuji BAS-UIs imaging plate에 부착시켜 48시간 동안 두어 감광시켰다.12)BAS-1500 bioimaging analyzer (Fuji Photo Film Co.
- 각 검체는 생리식염수에 용해하거나 1% CMC 용액에 현탁하여 투여하였다. 검액 조제시에는 생쥐의 경우에는 체중 kg당 10 ml가 투여되도록 하고, 흰쥐의 경우에는 체중 kg당 5 ml가 주입되도록 하였으며, 실험 직전에 조제하여 사용하였다.
- 분획하였다. 각 분획물의 투여용량은 앞서 검색했던 물엑스 500 mg/kg에 해당흐)는 양을 각 수율에 따라 계산하여 정하였다. 카라기난유발 부종을 생쥐에 적용시켰을 때, 각 분획물의 억제결과는 Table I에 표시하였다.
- 5 ml의 따듯한 에탄올에 용해시킨 후, 50~60℃의 증류수를 가하여 전체양이 50 ml가 되도록 하였고 실험기간 동안 40℃를 유지하도록 하였다. 검체는 PBQ 주입 직전에 정맥 내로 투여하였다.
- 1 ml를 흰쥐 뒷발바닥에 피하주사하고, 일정 시간 간격으로 뒷발의 용적(Vt)을 plethysmometer (Ugo Basile, Varese, Italy)로 측정하였다. 검체는 경구투여시에는 카라기난용액 주사 30분 전에 주입하였고, 정맥내로 투여할 때는 카라기난용액 주사 직전에 꼬리 정맥으로 주입하였다. 부종 유발전의 용적(Vn)을 기준으로 하여 그 증가율을 아래의 식으로 계산하였다.
- , Japan)를 사용하여 prostanoid bands를 정량하였다. 검체의 COX-1 억제 정도는 검체 대신 DMSO만 처리한 대조군의 14C-labelled prostanoid의 양과 비교 (% of control)하였다.
- , Japan)에 의해 정량하였다. 대조군과 검체처리군의 prostanoid의 양을 비교하여 검체의 COX-2 억제 정도를 검색하였다.
- 1 ml씩을 흰쥐의 발바닥에 피하주사하여 염증을 유발시키고, 2시간 후에 검체를 투여한 다음, 일정시간 후에 analgesy meter로 동통역치 (g)를 측정하였다. 동통역치는 흰쥐의 발바닥에 16g/sec의 속도로 서서히 압력을 가하여, 흰쥐가 발을 빼려고 하거나 몸을 뒤틀 때를 동통반응으로 하였다. 또, Swin-gle의 방법10)에 따라서 약물 투여군의 각 동통역치가 대조군의 평균 동통역치의 표준편차의 2배보다 더 클 때를 동통의 억제작용 (protected)으로 하여 진통작용을 표시하였다.
- 동통역치는 흰쥐의 발바닥에 16g/sec의 속도로 서서히 압력을 가하여, 흰쥐가 발을 빼려고 하거나 몸을 뒤틀 때를 동통반응으로 하였다. 또, Swin-gle의 방법10)에 따라서 약물 투여군의 각 동통역치가 대조군의 평균 동통역치의 표준편차의 2배보다 더 클 때를 동통의 억제작용 (protected)으로 하여 진통작용을 표시하였다.
- 즉, 흰쥐를 하룻밤 절식시킨 뒤, analgesy meter (Ugo Basile, Vhrese, Italy)를 이용하여 300 g의 압력에서도 반응하지 않는 흰쥐를 먼저 제외시킨 다음, 20% brewer's yeast.생리식염수 현탁액 0.1 ml씩을 흰쥐의 발바닥에 피하주사하여 염증을 유발시키고, 2시간 후에 검체를 투여한 다음, 일정시간 후에 analgesy meter로 동통역치 (g)를 측정하였다. 동통역치는 흰쥐의 발바닥에 16g/sec의 속도로 서서히 압력을 가하여, 흰쥐가 발을 빼려고 하거나 몸을 뒤틀 때를 동통반응으로 하였다.
- 검체는 낭 내 주입시 2% CMC.생리식염액에 함께 현탁시켜 주입하였고, 정맥 내 투여시 2% CMC.생리식염액 투여직전에 주입하였다.
- 7% 초산. 생리식염액을 씩 생쥐의 복강내에 주사하여 혈관투과성을 증대시키고, 30분 후에 pontamine sky blue 4%액 0.1ml 씩을 꼬리에 정맥주사하였다. 30분 후, 복강 액을 채취하여 3000rpm에서 10분간 원심분리 한 다음, 자외부 흡수스펙트럼하에서 혈관 투과성의 정도를 검정하였다.
- 순화기간 중 건강하다고 판정된 흰쥐에 대하여 체중을 측정하고 평균 체중에 가까운 개체들이 골고루 들어가도록 무작위법을 이용, 군분리를 실시하였다. 흰쥐 6마리를 1군으로 하여 검체를 349 및 500 mg/ kg을 정맥주사한 후, 1주일 까지의 사망수를 계수하였다.
- 숫컷 생쥐의 직장체온을 디지털 전자체온계 (Shiba- ura Electronics, Japan)로 측정한 다음, 안정적인 것을 선택하여 검체를 정맥투여하였다. 정맥투여 5분, 1 시간 및 3시간 후에 직장체온을 다시 측정하여 변화를 관찰하였다.
- 소염진통작용을 추구한 것이다. 실험 실시에 있어서 전보에서 지적한 바와 같이 중국에서 정맥투여 제제가 소개되어 있으므로2)이 실험에서도 정맥투여로서 효능실험을 실시하였다.
- 이 실험에 사용한 백두옹은 시중 한약 건재상에서 구입하였고, 수욕상에서 4시간씩 3회 추출 여과하고 여액을 감압농축하여 조말한 백두옹을 증류수로 수욕상에서 &시간씩 3회 추출 여과하고 여액을 감압 농축하여 물 추출물을 얻었고, 이 건조 엑스를 chlo-roform, ethyl acetate 및 butano로 계통적으로 분획을 실시하고 나머지 물층과 함께 감압농축하고 건조하여 검체로 하였다.
- , USA)로 측정하였다. 이때 BSA를 표준물질로 하여 단백질량을 측정하였다. 검체는 낭 내 주입시 2% CMC.
- 이미 전보1)에서 백두옹 엑스가 소염진통작용이 있음을 확인하였기에 이 엑스를 분획하여 chloroform, ethyl acetate, butanol 및 물 분획물을 얻었다. 이들에 대한 항부종작용 실험결과, 물 분획물이 349 mg/ kg의 용량에서 60~67%의 강력한 억제작용을 나타냈는데, 이는 물엑스로서 500 mg/kg에 해당된다.
- 선택하여 검체를 정맥투여하였다. 정맥투여 5분, 1 시간 및 3시간 후에 직장체온을 다시 측정하여 변화를 관찰하였다.
- 삼출액중 단백질의 양은 Bradford의 방법 7'으로 정량하였다. 즉 삼출액 일정량을 취해 원심분리하여 백혈구를 침전시키고, 상징액 100 W와 Bio-rad 단백 분석용 염색시약 5ml를 5분간 반응시킨 후, 610nm에서 microplate reader (Molecular Devices Co. Ltd., USA)로 측정하였다. 이때 BSA를 표준물질로 하여 단백질량을 측정하였다.
- 실시하였다. 즉, 200-250 g의 흰쥐 7마리를 1 군으로 하여 등부위의 털을 제거하고 소독하여 공기 8 ml을 피하주사하여 air-pouch를 형성시켰으며, 공기낭이 형성된 24시간 뒤, 멸균된 2% CMC. 생리식염액 5ml을 공기낭 내에 주입하여 백혈구유주를 유발시켰다.
- 즉, 25 g 내외의 생쥐에 0.02%의 phenyle- benzoquinone(PBQ) 에탄올수용액을 0.1ml/10g씩 복강 주사한 5분후부터 10분간의 writhing증상의 발생 수를 계수하였다. 이때 PBQ는 10 mg을 2.
- 즉, 체중 150-160 g의 흰쥐를 하룻밤 절식시킨 뒤, 뒷발의 용적(Vn)을 측정하였다. 1% 카라기난-생리식염액 0.
- 같다. 진통작용이 지속적인 지의 여부를 판정하기 위하여 검체 주입 후 3시간까지의 동통역치를 측정하였다. 대조군의 염증을 유발한 발의 동통역치는 검체 투여 3 시간까지 지속적으로 정상발에 비하여 동통역치가 현저히 낮아져 통증이 확실히 유발되었고 또, 지속적임을 나타내었다.
- 항부종작용 - 물 추출물을 계통적으로 분획하였다. 각 분획물의 투여용량은 앞서 검색했던 물엑스 500 mg/kg에 해당흐)는 양을 각 수율에 따라 계산하여 정하였다.
- 실시하였다. 흰쥐 6마리를 1군으로 하여 검체를 349 및 500 mg/ kg을 정맥주사한 후, 1주일 까지의 사망수를 계수하였다. 이 때, 체중을 시험기간 중 4회 측정하였다.
- 한편, 대조약물인 piroxicam 2 ㎎/㎏ 투여군에서도 카라기난 주입 3시간째에만 유의적이었다. 흰쥐에 다시 각 분획물의 카라기난 유발 부종을 적용시켜 그 효과를 비교하였다.
대상 데이터
- (Japam)의 제품을, 단백질 분석 용 시약은 Bio-rad (USA)의 것을, [1-14C] arachidonic acid는 Dupont Company (USA)의 제품을 사용하였다. HEL cell과 J774A.1 celle American Type Culture CoUetion (USA)을 사용하였으며, TLC aluminium sheet (silica gel 60 W)는 E. Merck (Ger-many)의 제품을 사용하였다. 기타 시약 및 추출 용매는 대한약전품 또는 분석용 일급시약을 사용하였다.
- Cy-clooxygenase(COX)-l assay에는 human erythroleukemia cell Hne(HEL)을 사용하였으며, Moroney 등11) 의 방법을 사용하였다. HEL세포주는 37℃, 5% CO2 및 100% 습도가 유지되는 인큐베이터에서 배양하였으며, 배지는 5% fetal bovine serum 및 lOOXanti- bioticantimycotic 용액을 함유한 RPMI 1640 배지를 사용하였다. 3~ 4일간 배양시킨 HEL 세포주를 24-well microtiter plate에 2X106cells/wello] 되도록 분주한 다음, 각 농도의 검체를 처리하여 상기와 같은 조건의 인큐베이터에 두었다.
- 이 혼합물에 ethyl acetate를 첨가하여 arachidonic acid의 cyclooxygenase0!] 의한 대사산물인 prostanoid를 추출하였다. prostanoid는 TLC 전개 후 autoradiography (Fuji Photo Film Co. Ltd., Japan)에 의해 정량하였다. 대조군과 검체처리군의 prostanoid의 양을 비교하여 검체의 COX-2 억제 정도를 검색하였다.
- 체중 20~ 30 g의 ICR계 수컷 생쥐와 체중 100~ 250 g의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 서울대학교 천연물과학연구소로부터 공급받아 2주일 이상 적응시킨 후, 실험에 사용하였고, 사육시에는 삼양유지의 고형사료 및 상수를 자유로이 섭취토록 하였다. 동물실 내 (22-25℃)의 명암은 12시간씩으로 자동조절시켰다.
- 활성화시킨 mouse macrophage cells (J774A.1) 을 사용하였다. 세포배양과 enzyme inductione Arias 등13)의 방법에 준하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균치와 표준오차로 나타내었고, 각 군간의 비교는 Student's t-test를 사용하였으며, 대조군과 비교하여 p 값이 5% 미만일 때를 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- 정량함으로써 억제효과를 검사하였다. Cy-clooxygenase(COX)-l assay에는 human erythroleukemia cell Hne(HEL)을 사용하였으며, Moroney 등11) 의 방법을 사용하였다. HEL세포주는 37℃, 5% CO2 및 100% 습도가 유지되는 인큐베이터에서 배양하였으며, 배지는 5% fetal bovine serum 및 lOOXanti- bioticantimycotic 용액을 함유한 RPMI 1640 배지를 사용하였다.
- Hendershot 등의 방법**에 준하여 실시하였다. 즉, 25 g 내외의 생쥐에 0.
- Whittle 등의 방법 5에 준하여, 검체가 단백질 친화성 색소의 모세혈관 투과성에 미치는 영향을 검토하였다. 즉, 0.
- 즉, 위의 과정을 거친 cell에 IpM calcium ionophore A 23187, [1-14C] arachidonic acid solution,IM citric acid를 넣어 10분간 반응시켰다. 이 혼합물에 ethyl acetate를 첨가하여 arachidonic acid의 cyclooxygenase0!] 의한 대사산물인 prostanoid를 추출하였다. prostanoid는 TLC 전개 후 autoradiography (Fuji Photo Film Co.
- 검체가 백혈구유주에 미치는 영향을 평가하기 위하여 CMC air-pouch 법6)으로 실험을 실시하였다. 즉, 200-250 g의 흰쥐 7마리를 1 군으로 하여 등부위의 털을 제거하고 소독하여 공기 8 ml을 피하주사하여 air-pouch를 형성시켰으며, 공기낭이 형성된 24시간 뒤, 멸균된 2% CMC.
- , IL, USA)을 이용하여 계수하였다. 삼출액중 단백질의 양은 Bradford의 방법 7'으로 정량하였다. 즉 삼출액 일정량을 취해 원심분리하여 백혈구를 침전시키고, 상징액 100 W와 Bio-rad 단백 분석용 염색시약 5ml를 5분간 반응시킨 후, 610nm에서 microplate reader (Molecular Devices Co.
- 1) 을 사용하였다. 세포배양과 enzyme inductione Arias 등13)의 방법에 준하였다. J774A.
- 체중 100-110 g의 흰쥐를 1군 8마리로 하여 Randall 및 Selitt8) 방법에 준하여 실시하였다. 이 방법은 염증부위의 동통에 대한 감수성을 증대시켜 그 증대된 감수성이 진통제에 의해 억제되는 것에 기초한 것이다.
성능/효과
- 1 macrophage에서 검체는 COX-2의 activity를 약간 억제하는 것으로 나타났다. Cell에 검체를 전처치하였을 때 cell 독성은 없는 것으로 나타났으며, 미리 aspirin을 처치함으로써 COX -1 의 활성을 제거한 상태에서 COX-2 활성의 억제 정도를 검토하였을 때, 백두옹 냉수추출물의 물분획 10, 20, 40, 80, 160 및 320㎍/ml를 처리하였을 때, 대조군 즉, 검체 대신 DMSO만을 처리하였을 때에 비하여 각각 16.6, 17.7, 23.7, 33.8, 39.4 및 46.3%를 억제함으로써 용량의존적으로 억제하는 것으로 나타났으나 강력한 억제효과는 아니었으며, 은 320 ㎍/ml 이상이 될 것으로 보인다.
- 4에 표시하였다. LPS로 처리한 J774A.1 macrophage에서 검체는 COX-2의 activity를 약간 억제하는 것으로 나타났다. Cell에 검체를 전처치하였을 때 cell 독성은 없는 것으로 나타났으며, 미리 aspirin을 처치함으로써 COX -1 의 활성을 제거한 상태에서 COX-2 활성의 억제 정도를 검토하였을 때, 백두옹 냉수추출물의 물분획 10, 20, 40, 80, 160 및 320㎍/ml를 처리하였을 때, 대조군 즉, 검체 대신 DMSO만을 처리하였을 때에 비하여 각각 16.
- 모세혈관 투과성에 미치는 영향을 검토한 결과이다. Saline 투여군의 복강내에 삼출된 pontamine sky blue의 농도가 156.3 μg인데 비하여 물분획 175 ㎎/㎏ 투여시에는 78.9μg으로써 49.5%를 억제하였으며, 349mgkg 투여시에는 67.0 |ig으로써 57.1%의 높은 억제율을 나타내어 대조군과 유의적인 차이를 보였다. 이것은 대조약물인 piroxicam 2 ㎎/㎏ 투여군보다도 더 높은 억제 효과를 나타낸 것이다.
- 결론적으로 백두옹 엑스의 물 분획물을 정맥내 투여하였을 때, 카라기난유발 부종을 지속적으로 억제하며, 모세혈관 투과성 억제 및 백혈구 유주 억제 작용을 가지는데 그 작용기전의 일부는 COX에 의한 prostanoids의 합성을 저해하는 것으로 생각된다. 또한, PBQ 유발 writhing을 억제하고 Randall-Selitto법에 의한 동통을 억제하였으며 정상체온에 영향이 없는 용량에서 소염 진통효과를 인정할 수 있었다.
- acetate 분획 및 butanol 분획의 투여시에는 부종을 억제하지 못하였다. 그러나 가장 높은 수율을 나타낸 물 분획물 349㎎/㎏ 투여시에는 카라기난 주입 후 1, 2, 3 및 4시간에 각각 대조군에 비하여 60.9%, 64.4%, 67.4% 및 63.8%의 높은 억제율을 보이며 유의적인 차이를 나타내었다. 이것은 부종 억제 정도가 대조약물인 piroxicam 2 mgekg 투여군과 비슷하였다.
- DM SO만을 처리한 대조군은 arachidonic acid의 COX-1 에 의한 대사산물인 prostaglandin F2a, thromboxane B2, prostaglandin E2, prostaglandin & 및 5-HETE 모두 진한 밴드를 나타내어 많은 양이 생성되었음이 보여진다. 그러나 검체를 처리하였을 때는 밴드의 색이 농도가 증가함에 따라 점점 흐려졌으므로 COX-1 의 활성을 저해하여 각 대사산물의 생성 양이 줄어들었음을 육안으로도 확인할 수 있었다. 이것을 정량하여 그 억제정도를 검정한 결과는 Fig.
- 이 결과는 Table IV에 표시하였는데, 카라기난유발 부종실험의 경우와 마찬가지로 chloroform, ethyl acetate 및 butanol 분획물의 투여시에는 PBQ유발 writhing 증상을 전혀 억제하지 못하였다. 그러나 물 분획물 349 mg/ kg을 투여하고 PBQ 주입 5분후부터 10분간의 writhing 증상의 발생수는 대조군에 비해 70% 이상의 높은 억제율을 나타내었다. 특히, PBQ 주입 10분 후부터 5분간의 writhing 증상의 억제 정도는 84.
- 진통작용이 지속적인 지의 여부를 판정하기 위하여 검체 주입 후 3시간까지의 동통역치를 측정하였다. 대조군의 염증을 유발한 발의 동통역치는 검체 투여 3 시간까지 지속적으로 정상발에 비하여 동통역치가 현저히 낮아져 통증이 확실히 유발되었고 또, 지속적임을 나타내었다. 물분획 175 mg/kg을 투여하였을 때, 2시간까지 동통역치가 100 이상을 나타내어 유의적인 효과를 보였고, 3시간째에도 93.
- Mitchell 등33)은 aspirin의 IC%이 COX-1 에서 5㎍/ml이고, COX-2에서 100 ㎍/ml 이상인 것으로 보고하였다. 따라서 이 검체는 aspirin과 비슷한 COX 억제효과를 나타내는 용량에서, 소염 작용을 나타내게 하기위하여 검체를 정맥투여하는 경우에는 경구시보다 더 작은 용량을 투여하게 되므로, as- pirin의 위손상을 방지하게 되어 더 바람직한 COX 억제제가 될 것으로 보인다. 이 물분획을 정맥내 투여하였을 때, 소염 및 진통작용을 나타내는 용량인 175 ㎎/㎏ 투여군에서 정상체온에 아무런 영향을 미치지 않음이 확인되었으며, 급성 독성 시험 시, 중간치사량(L %)이 500 ㎎/㎏ 이상으로 나타났다.
- 그 밖의 분획물은 전혀 작용이 없었다. 따라서 혈관투과성 및 백혈구유주실험에서는 물 분획물에 대하여 175 및 349 mg/kg의 두 용량에서 실시한 바, 모두 유효한 작용을 인정할 수 있었다. 또, 진통작용 실험에서 물 분획물이 PBQ유발 writhing의 억제를 나타내었고 그 밖의 분획물은 억제되지 아니하였다.
- 이것도 물엑스 500 ㎎/㎏에 해당되는 용량에서 실시한 결과이다. 따라서, 물 분획물에 대하여 175 및 349mgkg의 두 용량에서 Randall-Selitto법으로 진통작용실험을 실시한 바, 이 검체 175 ㎎/㎏ 투여시의 진통작용이 piroxicam 2 ㎎/㎏의 용량과 유사함을 알 수 있었다. 현재까지 소염작용 물질들은 급성염증에서 손상된 조직의 세포나 염증에 관여하는 세포 또는 주화인자에 의해 유주된 백혈구의 세포막으로부터 물리화학적 및 생리적 자극에 의해 활성화 된 phospholipase에 의해 유리되는 arachidonic acid의 cyclooxygenase 대사에 의한 prostaglandin류의 생합성을 억제하는 약물들이었다.
- 또한, PBQ 유발 writhing을 억제하고 Randall-Selitto법에 의한 동통을 억제하였으며 정상체온에 영향이 없는 용량에서 소염 진통효과를 인정할 수 있었다. 또, 급성독성은 LD50이 500 ㎎/㎏ i.
- 4로써 2시간째보다 줄어들긴 하였으나 대조군에 비하여 유의적으로 동통 역치가 높아졌다. 물 분획물 349 mg/kg 투여군은 투여 직후의 동통역치가 119.6으로써 대조군에 비해 유의적인 증가를 보였으며, 1, 2, 3시간째에는 모두 150 이상의 동통역치를 나타내었고 억제율(protected per- cent)도 각각 62.5%, 62.5% 및 87.5%로써 진통작용이 지속적임을 보였다. 이것은 대조약물인 piroxicam 2 ㎎/㎏ 투여군보다도 더 강력한 효과이다.
- 5%나 억제되어 유의적인 차이를 보였다. 물 분획물 349mgkg 투여군은 nun3당 백혈구 수가 3559개로써 대조군에 비해 매우 유의적인 억제 효과를 나타내었으며, 그 억제 정도는 73.6%로써 대조약물인 piroxicam 2 ㎎/㎏ 투여군이 68.7%의 억제율을 보인 것보다도 강력한 효과이다. 이 결과는 Fig.
- 물 분획물의 급성독성 - 흰쥐에 물 분획물 500 mg/ kg을 정맥투여하였을 때, 6마리중 2마리가 사망하였고, 349 ㎎/㎏을 투여하였을 때는 한 마리도 사망하지 않아 이 검체 정맥투여시 반수치사량(LDso)은 500 ㎎/㎏ 이상으로 나타났다(Eble VH). 또한, 이 검체투여 시의 체중 변화는 Table VIH에 표시하였다.
- 물 엑스 각 분획물의 수율 - 백두옹 1791g을 10 시간씩 3회 수욕상에서 물로 추출하여 얻은 침출액을 동결건조하였을 때, 377 g의 엑스를 얻어 21%의 수율을 나타내었다. 이 엑스로 분획을 실시하였을 때, chloroform 분획이 각각 1.
- 대조군의 염증을 유발한 발의 동통역치는 검체 투여 3 시간까지 지속적으로 정상발에 비하여 동통역치가 현저히 낮아져 통증이 확실히 유발되었고 또, 지속적임을 나타내었다. 물분획 175 mg/kg을 투여하였을 때, 2시간까지 동통역치가 100 이상을 나타내어 유의적인 효과를 보였고, 3시간째에도 93.4로써 2시간째보다 줄어들긴 하였으나 대조군에 비하여 유의적으로 동통 역치가 높아졌다. 물 분획물 349 mg/kg 투여군은 투여 직후의 동통역치가 119.
- 따라서 이 검체는 aspirin과 비슷한 COX 억제효과를 나타내는 용량에서, 소염 작용을 나타내게 하기위하여 검체를 정맥투여하는 경우에는 경구시보다 더 작은 용량을 투여하게 되므로, as- pirin의 위손상을 방지하게 되어 더 바람직한 COX 억제제가 될 것으로 보인다. 이 물분획을 정맥내 투여하였을 때, 소염 및 진통작용을 나타내는 용량인 175 ㎎/㎏ 투여군에서 정상체온에 아무런 영향을 미치지 않음이 확인되었으며, 급성 독성 시험 시, 중간치사량(L %)이 500 ㎎/㎏ 이상으로 나타났다. 그러므로, 백두옹 냉수추출물의 물분획은 소염 및 진통물질로서의 개발을 목표로하여 colunm chromathgraphy에 의한 성분분리를 실시하여 순수물질을 분리할 가치가 있다고 사료되는 바이다.
- 이들에 대한 항부종작용 실험결과, 물 분획물이 349 mg/ kg의 용량에서 60~67%의 강력한 억제작용을 나타냈는데, 이는 물엑스로서 500 mg/kg에 해당된다. 그 밖의 분획물은 전혀 작용이 없었다.
- 그러나 물 분획물 349 mg/ kg을 투여하고 PBQ 주입 5분후부터 10분간의 writhing 증상의 발생수는 대조군에 비해 70% 이상의 높은 억제율을 나타내었다. 특히, PBQ 주입 10분 후부터 5분간의 writhing 증상의 억제 정도는 84.2%로써 대조약물인 piroxicam 2 ㎎/㎏ 투여군보다도 더 강력한 억제효과를 보인 것이다.
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