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문제 정의
- 거의 없었다. 이에 본 연구에서는 기존 검출법에서 나타난 단점을 보완하고 식품 중에 있는 PA를 검출하기 위하여 효소면역측정법(ELISA)을 개발하고 이를 식품분석에 적용하고자 하였다.
제안 방법
- PA-BSA conjugate를 면역원으로 사용하기 위하여 bromoacetyl chloride [Be] method, "와 일부 수정한 periodate oxidation [Po] method(8)의 두 가지 방법으로 bovine serum albumin(BSA)에 conjugation하여 PA- BSA conjugate를 제작하였다.
- Each rabbit was immunized with P^-BSA[Bc] on weeks 0, 2, 4 and 6, and bled once every week after each immunization. NRS; normal rabbit serum.
- . Lactobacilli MRS Broth(Difco) 에서 균주를 계대배양하였고 pantothenate assay medium(Difco>5로 다음과 같이 분석하였다(11).
- PA에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하기 위하여(9) 면역원으로 준비한 PA-BSA conjugate(Rk-BSA [Be])와 Freund's complete adjuvant을 동량비로 혼합하여 유탁액을 만든 후, 체중 2~3kg가량의 횐토끼(New Zealand White 종) 2마리의 뒷 발바닥에 각각 1 mL (0.5mg/mL)씩 주사하였다. 이후 추가면역을 위해 Freund's incomplete adjuvant를 사용하여 면역원과 동일한 방법으로 유탁액을 만든 후 2주 간격으로 피하주사하였다.
- PA의 유도체에 대한 교차반웅(Cross-reactivities}을 간접 경합 ELISA로 검토하였다. Rk-BSA[Po](10ng/mL) 를 microplate에 100μL씩 넣어 4P에서 하룻밤 방치하여 코팅하였다.
- Rk-BSA[Po](10ng/mL) 를 microplate에 100μL씩 넣어 4P에서 하룻밤 방치하여 코팅하였다. Washing buffei로 3회 세척한 후 1% BSA가 첨가된 washing buffer로 희석한 항 PA- BSA[Bc] 항체와 R\ 및 pantothenic acid 유도체인 pantoyllactine, pantetheine, pantothenyl alcohol, acetyl CoA용액를 각각 1:1 로 혼합하여 microplate에 100 pL씩 넣어 경합반응이 일어나도록 하였으며, 그 이후 실험과정은 간접 비경합 ELISA의 과정과 동일하게 실험하여 흡광도를 측정, 분석하였다. 그리고, ciELISA에의해 얻어진 결과를 가지고 다음 식과 같이 교차반웅율을 계산하였다.
- 코팅하였다. Washing buffer로 3회 세척한 후 1% BSA가 첨가된 washing buffer로 회석한 EA 용액과 항 B\-BSA[Bc] 항체를 동량비로 흔합한 용액 100 μL을 넣은 후 1시간동안 반응시켜 경합반응이 일어나도록 하였으며, 다시 washing buffer로 3회 세척하고나서 나머지 과정은 간접 비경합 ELISA와 같은 방법 즉, goat anti-rabbit IgG antibody-HRP과 기질용액을 반응시킨 후 측정한 흡광도의 평균값으로 분석하였다.
- 면역한 후 1주일 뒤에 토끼의 귀정맥으로부터 채혈하여 3시간 가량 실온에서 방치하여 혈액을 응고시킨 후 약 2시간동안 냉장보관한 다음, 원심분리 (3,000×g, 10분)하여 항혈청을 분리하였으며, sodium azide를 0.02%되게 첨가하여 -70P에 냉동보관하면서 사용하였다.
- PA의농도를 Ong에서 100ng의 범위 안에서 10ng 간격으로 달리하여 100 pL씩 첨가한 pantothenate assay medium 10mL에 희석한 균체를 접종하여 37℃, 22시간 배양하였다. 미생물의 성장도를 620 nm에서의 흡광도로 측정하여 표준곡선을 작성하였다.
- 0) 10 mL에 넣고 12FC 15분간 멸균한 후 Omni-Mixer Homogenizer를 이용하여 30분 이상 균질화하였다. 시료 속의 PA의 분리를 위해 calf intestinal alkaline phosphatase(200 unit)와 pigeon liver peptidase를 첨가하여 실온에서 하룻밤 효소 반응시켰다. 이후 0.
- 식품 시료로부터 PA의 추출은 Finglas(12)와 Walsh(2) 의 방법을 변형하여 행하였다. 계란은 난백과 난황을 혼합한 것을 사용하였고 상추는 잎맥부분이 없는 곳을 골라 사용하였으며 소간은 잘게 썬 후 사용하였다.
- 식품시료인 계란, 소간, 상추 중에 존재하는 PA를 MBA법과 ciELISA에 의하여 분석하고, 그 결과를 서로 비교하였다. MBA법에 의해 PA의 검출에 사용한 표준곡선(Fig.
- 시료 속의 PA의 분리를 위해 calf intestinal alkaline phosphatase(200 unit)와 pigeon liver peptidase를 첨가하여 실온에서 하룻밤 효소 반응시켰다. 이후 0.2 M Tris bufifer(pH 8.0)로 부피를 100 mL로 맞추고 원심분리 (15, OOOXg, 20분)하여 상징액을 얻고, 이를 필요시 회석하여 분석에 사용하였다. 이때 pigeon liver peptidase 는 많은 양의 PA가 포함되어 있는 pigeon Hver acetone powder(2.
- 5mg/mL)씩 주사하였다. 이후 추가면역을 위해 Freund's incomplete adjuvant를 사용하여 면역원과 동일한 방법으로 유탁액을 만든 후 2주 간격으로 피하주사하였다.
-
항 PA-BSA[Bc]항체의 특이성
특이항체의 특이성을 조사하기 위하여 대표적인 PA 유도체들에 대한 교차반웅을 재료 및 방법에 명시한바와 같이 ciELISAS- 검토하였다. Fig.
- 0) 100 gL을 넣어 상온에서 30분 동안 발색반응을 확인한 후 2 M H2SO4 50μL로 반응을 정지시키고, microplate reader로 파장 450nm에서 각 well의 흡광도를 측정하였다. 하나의 시료에 대하여 3개씩의 well을 사용하여 얻은 흡광도의 평균값으로 분석하였다.
대상 데이터
- 방법을 변형하여 행하였다. 계란은 난백과 난황을 혼합한 것을 사용하였고 상추는 잎맥부분이 없는 곳을 골라 사용하였으며 소간은 잘게 썬 후 사용하였다.
- 2에나타난 바와 같이 면역원에 대해 특이적으로 결합하는 항PA-BSA[Bc] 항체가 생성되었음을 확인할 수 있었다. 추가면역에 따라 대체로 항체가가 조금 중가하는 것을 알 수 있었으며, 이 중 항체가가 매우 높고 많은 양의 혈청을 채취한 1번 토끼의 3차 항혈청을 사용하였다.
데이터처리
- ciELISA 방법으로 시료에 함유되어있는 PA를 분석하였으며, 그 결과를 MBA 결과와 비교하였다(Table 1). MBA에 대한 ciELISA의 분석회수율의 경우, 계란과 소간은 각각 109% 및 64%로 비교적 양호하였다.
이론/모형
- Lactobacillus plantarum(KCCM 11542)를 이용하여 Association of Official Analytical Chemists(AOAC)법에 따라 실시하였다(10). Lactobacilli MRS Broth(Difco) 에서 균주를 계대배양하였고 pantothenate assay medium(Difco>5로 다음과 같이 분석하였다(11).
- 항체의 역가는 간접 비경합 EUSA(non-competitive ELISA}에 의해 측정하였다. 즉, PA-BSA(Rk-BSA[Bc] 혹은 PA-BSA[Po])> coating buffer(0.
성능/효과
- 비교하였다. MBA법에 의해 PA의 검출에 사용한 표준곡선(Fig. 5)E로부터 그 검출한계는 lOppb인 것을 확인할 수 있었으며, 각 시료로부터 추출해낸 PA 농도를 산출한 결과, 대체로 식품성분분석표(15)와 유사한 결과를 보였다(Table 1). 다만, 계란의 경우 2.
- PA-BSA[Bc}를 면역한 토끼에서 얻은 항혈청의 항체 역가를 간접 비경합 ELISA로 분석한 결과, Fig. 2에나타난 바와 같이 면역원에 대해 특이적으로 결합하는 항PA-BSA[Bc] 항체가 생성되었음을 확인할 수 있었다. 추가면역에 따라 대체로 항체가가 조금 중가하는 것을 알 수 있었으며, 이 중 항체가가 매우 높고 많은 양의 혈청을 채취한 1번 토끼의 3차 항혈청을 사용하였다.
- PA를 분석하기 위한 ciELISA의 조건을 확립하기 위하여 두 종류의 항원(RA-BSA[Bc] 흑은 PA-BSA[Po]) 을 microplate에 코팅을 하고, 1% BSA가 첨가된 washing buffer로 회석한 특이항체를 이용하여 각각 ciELISA로 실험해 본 결과 R\-BSA[Po]을 코팅한 경우에는 양호한 경합반웅을 보였다. 이때, PA의 검출한계는 1 ppm이었다(Fig.
- 결론적으로 본 실험은 기존의 MBA 분석법과 비교하여 볼 때 RA의 analogue에 대해 교차반웅이 매우 낮고, 짧은 분석시간과 많은 시료를 동시에 간편하게 분석할 수 있는 ELISA를 개발하였다. 다만, 검출감도를 높이기 위한 양질의 특이항체생산이 요구된다.
- 5)E로부터 그 검출한계는 lOppb인 것을 확인할 수 있었으며, 각 시료로부터 추출해낸 PA 농도를 산출한 결과, 대체로 식품성분분석표(15)와 유사한 결과를 보였다(Table 1). 다만, 계란의 경우 2.3배가량의 높은 분석결과(4.2mg/100g)를 나타냈는데, 이는 분석에 사용한 계란은 영양란이었으며, 보통란보다 사양관리를 잘하였기 때문에 PA의 함량이 높았던 것으로 생각된다.
- 이 결과는 Finglasd(13)의 실험에서 MBA에 대한 ciELISA의 분석회수율이 계란과 소간의 경우보다 높은 257%이였던 결과와 유사하였다. 비록 본 실험의 결과가 높게 나타났지만, 상추의 경우 다른 시료와 비교하여 보았을 때 높게 나타난다는 사실을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 다만, 검출감도를 높이기 위한 양질의 특이항체생산이 요구된다. 앞으로 많은 식품시료로 PA 분석에 ELISA를 활용함으로써 분석의 효율성을 높일 수 있으리라 생각한다.
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