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문제 정의
- 나아가 세포의 에너지대사에 관여하는 다른 중요한 생체막들 인티라코이드막과 원형질막은 냉해 발현 온도구간에서 상전이를 일으키는지 여부도 규명하여야 할 사항이다. 본 연구는 이러한 의문들에 대한 구체적인 해답을 얻기 위하여 수행되었으며, 여기에 그 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 6) 초음파처리는 Ultrasonic disintegrator(MSE, Soniprep 150)로 20 ㎐에서 15초씩 4회 실시하였다. 티라코이드는 Leegood과 Malkin에 의해 기술된 방법을 일부 보완하여 분리하였다.
- 7,8) 원형질막의 분리는 Larsson 등에 의해 기술된 phase partitioning 방법에 준하였다.9,10) 즉, differential centrifugation에 따라 분리한 microsomal memb-ranes을 6.6%(w/w) dextran T-500과 6.6%(w/w) polyethylene glycol 3350의 two-phase system 에서 phase-partitioning 하였다.11)
- G6P와 F6P의 함량은 조직 추출액에 NADP와 G6P dehydrogenase 및 phosphoglucoisomerase를 첨가할 때 일어나는 NADP의 총환원량으로부터 계산하였다.17)
- 미토콘드리아막에 결합되어 있는 호흡전자전 달계의 속도결정단계로 알려진 cytochrome c oxidase와 해당과정의 주 조절효소로서 세포질에 존재하는 PFK를 대상으로하여 그 활성에 대한 Arrhenius plot을 얻었다(Fig. 3). 이로부터 측정된 cyto chrome c oxidase 활성의 상전이 온도는 미토콘드리아 막지질 의 물리적인 상전이 온도와 일치함을 알았다.
- 생장 최적온도(27℃)에서 재배한 유묘를 최적온도보다는 낮은 여러 온도에 48시간 동안 노출시킨 다음 노출 온도에 따른 생장력의 변화를 조사하였다. 생장력의 지표로 삼은 상부조직의 길이 (shoot height)와 건물중(dry weight)은 공히 온도가 내려갈수록 거의 직선적으로 감소하였으며 이러한 현상은 약 13℃까지 지속되었다.
- 생체막의 상전이 온도는 Fig. 1에 보여준 바와 같이 probe 물질인 16NSM의 ESR spectra를 이용하여 측정한 spin label motion(τ0)의 온도의존성을 나타내는. Arrhenius plot들로부터 구하였다.
- 한편, 상기한 바와 같이 재배한 유묘를 4~24℃의 온도범위내의 여러온도(약 2℃ 간격)에서 48시간 동안 암소에 노출시킨 후, 유묘의 생장력(유묘의 길이와 건물중량)의 변화를 측정하였다. 아울러 glucose 6-phosphate(F6P) 와 fructose 6-phosphate(F6P)의 함량분석을 수행하였다. 티라코이드는 따로 27℃, 30 W/m2의 광조건하에서 8일간 재배한 벼의 잎으로부터 분리하였다.
- methanol에 녹인 2mM 16NSM를 시험관에 넣고 질소로 methanol을 증발시킨 다음 SMP, 티라코이드또는 원형질막을 넣고 초음파처리함으로서 16NSM을 생체막에 삽입시킨 현탁액을 얻었다. 이 현탁액을 이용하여 0~40℃ 범위의 여러온도(2℃ 간격)에서 ESR spectra를 측정하였다(Fig. 1). spin label motion (τ0)은 다음 식을 이용하여 구하였다.
- submitochondrial particle(SMP), 원형질막의 분리 및 여러 가지 효소의 활성 측정에는 27℃ 암소에서 8일간 재배한 유묘의 잎을 사용하였다. 한편, 상기한 바와 같이 재배한 유묘를 4~24℃의 온도범위내의 여러온도(약 2℃ 간격)에서 48시간 동안 암소에 노출시킨 후, 유묘의 생장력(유묘의 길이와 건물중량)의 변화를 측정하였다. 아울러 glucose 6-phosphate(F6P) 와 fructose 6-phosphate(F6P)의 함량분석을 수행하였다.
대상 데이터
- 12,13) spin label로서 16번 탄소에 nitroxide가 결합된 methyl stearate인 16NSM(2-(14-carbomethoxytetradecyl)-2-ethyl-4, 4-dimethyl-3-oxazolidinyloxy)을 사용하였다. methanol에 녹인 2mM 16NSM를 시험관에 넣고 질소로 methanol을 증발시킨 다음 SMP, 티라코이드또는 원형질막을 넣고 초음파처리함으로서 16NSM을 생체막에 삽입시킨 현탁액을 얻었다.
- submitochondrial particle(SMP), 원형질막의 분리 및 여러 가지 효소의 활성 측정에는 27℃ 암소에서 8일간 재배한 유묘의 잎을 사용하였다. 한편, 상기한 바와 같이 재배한 유묘를 4~24℃의 온도범위내의 여러온도(약 2℃ 간격)에서 48시간 동안 암소에 노출시킨 후, 유묘의 생장력(유묘의 길이와 건물중량)의 변화를 측정하였다.
- 국립종자공급소에서 구입한 벼 종자(다산벼)를 암소에서 발아시킨 후, Hoagland 용액을 이틀에 한번씩 교환하면서 수경재배하였다. submitochondrial particle(SMP), 원형질막의 분리 및 여러 가지 효소의 활성 측정에는 27℃ 암소에서 8일간 재배한 유묘의 잎을 사용하였다.
- 이용하여 조사할 수 있다. 본 연구에서 사용한 16NSM은 이러한 요건을 갖춘 물질로서 그것이 결합되어 있는 막의 유동성 변화는 그 ESR spectra의 특징적 파라미터에 반영된다.13) 세포막의 상전이 온도는 여러 가지 요인에 의해 결정되지만 막의 주 구성물질인 극성지질의 지방산 조성이 가장 중요한 인자라는 것은 널리 인정된 사실이다.
이론/모형
- 티라코이드는 Leegood과 Malkin에 의해 기술된 방법을 일부 보완하여 분리하였다.7,8) 원형질막의 분리는 Larsson 등에 의해 기술된 phase partitioning 방법에 준하였다.9,10) 즉, differential centrifugation에 따라 분리한 microsomal memb-ranes을 6.
- 5) 20 ml 중에서 마쇄하고, 20,000g에서 10분간 원심분리하여 얻은 상징액을 phospho-fimctokinase(PFK)의 활성측정에 사용하였다. PFK의 활성은 Kruger와 Dennis에 의해 기술된 enzyme-coupled method를 이용하였으며,14) 미토콘드리아 내막의 생리 활성은 cytochrome c oxidase# 대상으로하여 Smith에 의해 기술된 방법에 준하여 측정하였으며,15) 이를 위해서 내막이 노출된 SMP를 준비하여 사용하였다. 단백질의 함량은 Lowry등에 의해 기술된 방법을 따라 측정하였다.
- PFK의 활성은 Kruger와 Dennis에 의해 기술된 enzyme-coupled method를 이용하였으며,14) 미토콘드리아 내막의 생리 활성은 cytochrome c oxidase# 대상으로하여 Smith에 의해 기술된 방법에 준하여 측정하였으며,15) 이를 위해서 내막이 노출된 SMP를 준비하여 사용하였다. 단백질의 함량은 Lowry등에 의해 기술된 방법을 따라 측정하였다.16)
- 생체막의 상전이 온도는 Gafihey에 의해 기술된 ESR spin labeling 방법에 따라서 측정하였다.12,13) spin label로서 16번 탄소에 nitroxide가 결합된 methyl stearate인 16NSM(2-(14-carbomethoxytetradecyl)-2-ethyl-4, 4-dimethyl-3-oxazolidinyloxy)을 사용하였다.
성능/효과
- 13) 세포막의 상전이 온도는 여러 가지 요인에 의해 결정되지만 막의 주 구성물질인 극성지질의 지방산 조성이 가장 중요한 인자라는 것은 널리 인정된 사실이다.1)즉 불포화도가 큰지방산의 조성비가 높을수록 막의 상전이 온도는 낮아진다. 세포에는 여러 종류의 생체막이 존재하나 세포 에너지 대사는 특히 미토콘드리아 내막, 티라코이드막 및 원형질막의 생화학적활성과 밀접한 관계가 있다.
- Arrhenius plot들로부터 구하였다. 각 plot 상의 불연속점으로 지시된 상전이 온도는 미토콘드리아 내막에서 13℃ 그리고 티라코이드막에서 7.5℃로 각각 확인되었다. 이에 반하여 원형질막의 경우는 최소한 0℃ 이상의 온도에서는 상전이를 보이지 않았다(Fig.
- 미토콘드리아 내막의 상전이 온도가 약 13℃로 측정되었고 이 온도를 분기점으로 하여 그 막의 대표적 생화학적 기능인 전자전달반응의 활성화에너지가 현저하게 (cytochrome c oxidase를 지표로 하여 측정하였을 때 약 2배정도) 변하였다는 관찰은 막의 물리적 상전이가 기능적 상전이에 직결됨을 의미한다. 세포대사의 주 에너지 형태인 ATP의 생합성이 전자전달 반응과 짝 지워져 있음을 고려할 때, 미토콘드리아 호흡활성이 갑작스럽게 떨어졌다는 사실(즉 호흡 활성화에너지가 불 연속적으로 그리고 큰 폭으로 증가하였다는 사실)은 전반적으로 세포 에너지 대사가 정지 상태, 나아가서 식물생장이 실질적으로 정지상태에 도달하였음을 의미한다.
- 상온에서 재배한 유묘를 4℃에 노출시킨 다음 F6P와 G6P의 경시적 함량변화를 측정한 결과 약 6시간의 저온처리 동안 에그 함량은 3배 이상 가파르게 증가하였으며 그 이후로는 거의 일정한 수준을 유지하였다. 48시간 저온처리한 유묘를 다시 상온하에 옮겼을 때 이들 해당반응 대사물의 함량은 급격하게 감소하여 6시간 후에는 저온처리를 받지 않았던 대조구의 수준에 접근하였다(Fig.
- 수 있다. 이러한 추론적 가능성을 검토하기 위하여 유묘의 노출(2일간) 온도와 대사물 축적량과의 상관관계를 조사한결과, 온도가 감소할수록 F6P와 G6P의 세포내 함량은 증가하였으며 온도-함량 곡선에서 그 변곡점이 12~15℃ 범위내에서 나타났다(Fig. 4).
- 3). 이로부터 측정된 cyto chrome c oxidase 활성의 상전이 온도는 미토콘드리아 막지질 의 물리적인 상전이 온도와 일치함을 알았다. 그러나 PFK의 경우에는 ATP-PFK나 PPi-PFK 공히 효소활성의 상전이를 보이지 않았다.
- 이상의 결과로부터, 벼 유묘(다산벼)가 13℃ 이하의 온도에놓이게 되면 상온하에서 그 세포내에 유지되던 해당과정-호흡과정 균형이 미토콘드리아막의 물리적, 기능적 상전이에 기인하여 깨지게 되며, 따라서 해당과정의 주조절효소인 PFK의 기질인 F6P가 축적되고 나아가 그 전단계 대사물인 G6P 역시 축적될 수 있다. 이러한 추론적 가능성을 검토하기 위하여 유묘의 노출(2일간) 온도와 대사물 축적량과의 상관관계를 조사한결과, 온도가 감소할수록 F6P와 G6P의 세포내 함량은 증가하였으며 온도-함량 곡선에서 그 변곡점이 12~15℃ 범위내에서 나타났다(Fig.
- 이러한 기대 역시 G6P와 F6P의 함량 분석결과와 일치하였다. 이상의 모든 결과들은 기능적상전이가 일어나지 않는 세포질 대사와 상전이가 일어나는 미토콘드리아 대사간의 불균형이 냉해기작의 최초과정이라는 본연구의 기본적 가정에 어느 정도 구체적인 근거를 마련한 것이라고 볼 수 있다.
후속연구
- 따라서 상전이 온도 이하의 한 저온에 노출된 유묘 내에는 해당반응대사 중간물들, 특히 주조절효소의 기질들이 축적될 것이며 유묘를 다시 상온으로 환원시키면 다시 기능을 회복한 미토콘드리아막의 생화학적 활성에 의해 빠르게 소모되어 정상적 수준으로 되돌아갈 것으로 기대된다. 이러한 기대 역시 G6P와 F6P의 함량 분석결과와 일치하였다.
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