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문제 정의
- , 1994). 따라서 본 연구에서는 우리나라 새우양식장에서 양식산 새우를 대량폐사 시키는 원인을 정확히 규명하기 위해 감염된 새우로부터 바이러스를 분리하여 원인 바이러스의 특성을 조사하였다.
가설 설정
- 바이러스 감염으로 인해 두흉갑 및 체표에 흰반점을 형성한 대하의 두흉부조직을 2.5% glutaraldehyde 액으로 24시간동안 전 고정하고 실온에서 2시간동안 1% osmium tetroxide 액으로고정하였다. 이어서 알코올계열로 탈수하여 푸로필렌옥사이드로 치환하고 Epon 812로 열중합해서 초미세절편기 (Reichert-Jung)로 박절(60-90 mm)하여 grid에 붙이고 uranyl acetade and lead citrate로 이중염색해서 투과전자현미경(Hitachi H-7100)으로 바이러스 입자형태를 관찰했다.
제안 방법
- pH 3과 11로 조정한 멸균해수 100 ml를 넣고 3시간 동안 정치하여 강산(pH 3)이나 강알칼리 (pH 11)에 대한 새우 바이러스의 감수성을 시험하였다.
- 감염새우를 수집하여 외부 증상을 육안 및 현미경올 통하여 관찰하였고 바이러스 감염새우를 실험실 사육수조에 수용하여 행동유형을 관찰하였고 새우 양식장에서 직접 또는 어민과의 전화 면접을 통하여 행동유형을 조사하였다.
- 5℃에서 10일간 새우배합사료(천하제일사료)를 소량씩 급이 하면서 새우 폐사유무를 관찰하였으며, 시험기간동안 수질악화를 방지하기 위해 매일 사육수량의 10%정도를 환수하였다. 그리고 사육수조에 바이러스액을 처리하지 않고 첨가한 감염구와 바이러스액을 첨가하지 않은 미감염구를 각각 감염 대조구와 미감염 대조구로 설정하였다.
- 냉동보관한 대하의 두흉부조직(간췌장, 림프기관, 위, 심장 둥)을 적출하여 유발에 넣고 10배량의 TN buffer(20 m Tris, 0.4 M NaCl, pH 7.4)첨가해서 저온상태에서 마쇄한 후 7,000Xg에서 15분간 원심분리(Sorvall RC5C)하여 상층액을 수획하였다. 수획한 상충액은 20,000Xg에서 2시간초원심분리 (Beckman L7)하여 pellet를 만든 다음, 3배량의 TNB로 재현탁해서 sucrose(20~50% w/ w)농도구배에서 200,000Xg로 3시간동안 초원심분리하여 바이러스를 분리하였다.
- /ml penicillin 및 streptomycin(Sigma)을 첨가한 배지로 배양하였다. 단충배양된 어류 주화세포에 바이러스에 감염된 새우 두흉부조직의 마쇄 여과액을 접종한 후 20℃에서 1주일간 배양하고 세포변성효과 (CPE) 가 나타나지 않으면 명목계대 (blind passage)를 2회 실시하여 바이러스를 배양하였다.
- 3시간 정도 전기영동한 다음 coomassie blue R-25O으로 염색하고 탈색하고 탈색액(50% methanol: 10% acetic acid)로 탈색하였다. 바이러스 단백질의 분자량은 표준단백질의 이동거리와 비교하여 결정하였다.
- TE에녹인 바이러스 핵산 10μ1를 eppendorf tube에 넣고 각 tube 에 제한효소 1 unit, 10X reaction buffer를 넣은 후 37℃에서 2시간동안 반응시킨 다음 1% agarose gel로 50 volts에서 2시간동안 전기영동하였다. 바이러스 핵산 band는 UV light상에서 확인하였다.
- 모아진 핵산은 TE buffer로 녹여서 실험에 사용할 때가지 -20℃에 보관하였다. 바이러스 핵산은 상법에 따라 BamH I, EcoR 1, Hind Ⅲ 등의 제한효소를 이용하여 전체 길이를 확인하였다. TE에녹인 바이러스 핵산 10μ1를 eppendorf tube에 넣고 각 tube 에 제한효소 1 unit, 10X reaction buffer를 넣은 후 37℃에서 2시간동안 반응시킨 다음 1% agarose gel로 50 volts에서 2시간동안 전기영동하였다.
- 바이러스액 4 ml가 들어있는 시험관에 에틸 에테르 1 ml를 첨가하고 4℃에서 18시간동안 진탕한후 에테르에 대한 새우 바이러스의 감수성을 시험하였다.
- 바이러스액 5ml를 넣은 실험관에 멸균해수 5 ml를 넣고 잘 혼든 후 50℃로 조정한 항온수조에서 30분간 방치하여 열(50℃)에 대한 새우 바이러스의 안정성을 시험하였다.
- 새우 대량폐사 원인 바이러스를 순수분리하기 위해 어류주화세포를 이용하여 세포 배양법으로 바이러스 배양을 시도하였다.
- 새우감염 바이러스의 핵산을 분석하기 위해 바이러스 농축액 100μl에 reaction buffer 10μl(10mM Tris pH6.7, 5mM EDTA pH8.0 and 1% SDS)와 proteinase K(20 mg/μl) 15 μl를 넣고혼합하여 55℃에서 2시간동안 전처리 하였다. phenol/chloroform으로 바이러스 핵산을 추출하고, 1/10의 3M 초산암모늄과 2배량의 무수에탄올을첨가하여 -20℃에 보관하면서 핵산을 침전시킨다.
- 4)첨가해서 저온상태에서 마쇄한 후 7,000Xg에서 15분간 원심분리(Sorvall RC5C)하여 상층액을 수획하였다. 수획한 상충액은 20,000Xg에서 2시간초원심분리 (Beckman L7)하여 pellet를 만든 다음, 3배량의 TNB로 재현탁해서 sucrose(20~50% w/ w)농도구배에서 200,000Xg로 3시간동안 초원심분리하여 바이러스를 분리하였다.
- 열, 강산, 강알카리 및 에테르 처리한 새우 바이러스액 전량을 해수가 들어있는 20 l아크릴 수조에 각각 넣고 건강한 대하치하(평균체중 0.5 g) 10 미씩을 수용한 다음, 수온 25±0.5℃에서 10일간 새우배합사료(천하제일사료)를 소량씩 급이 하면서 새우 폐사유무를 관찰하였으며, 시험기간동안 수질악화를 방지하기 위해 매일 사육수량의 10%정도를 환수하였다. 그리고 사육수조에 바이러스액을 처리하지 않고 첨가한 감염구와 바이러스액을 첨가하지 않은 미감염구를 각각 감염 대조구와 미감염 대조구로 설정하였다.
- 5% glutaraldehyde 액으로 24시간동안 전 고정하고 실온에서 2시간동안 1% osmium tetroxide 액으로고정하였다. 이어서 알코올계열로 탈수하여 푸로필렌옥사이드로 치환하고 Epon 812로 열중합해서 초미세절편기 (Reichert-Jung)로 박절(60-90 mm)하여 grid에 붙이고 uranyl acetade and lead citrate로 이중염색해서 투과전자현미경(Hitachi H-7100)으로 바이러스 입자형태를 관찰했다.
- 즉 농축, 정제된 새우감염 바이러스를 동량의SDS-sample buffer(2.3% SDS: 0.05 mM Tris, pH6.8: 10% glycerol(w/v): 5% 2-mecapto-ethanol)와 혼합하여 끊는 물에 2분간 처리하고 10,000Xg에서 10초간 원심분리 하여 시료를 준비하였다. 준비된 시료를 10% polyacrylamide gel에 loading하여 200 voltS.
대상 데이터
- 바이러스 배양에 사용한 어류주화세포는 CHSE-214, RTG-2, EPC, FHM, 및 BF-2이며, 이들 어류주화세포는 DMEM 기본배지에 10% FBS(Gibco), lOmM glutamime(Gibco), 100 I.U./ml penicillin 및 streptomycin(Sigma)을 첨가한 배지로 배양하였다. 단충배양된 어류 주화세포에 바이러스에 감염된 새우 두흉부조직의 마쇄 여과액을 접종한 후 20℃에서 1주일간 배양하고 세포변성효과 (CPE) 가 나타나지 않으면 명목계대 (blind passage)를 2회 실시하여 바이러스를 배양하였다.
- 서해안 지역(경기 화성, 충남 태안, 전북 고창및 부안, 전남 영광)의 새우양식장에서 발병한 양식산 대하를 1993년부터 현지에서 수집하여 실험에 사용할 때까지 -85℃에서 냉동 보관하였다.
이론/모형
- 새우감염 바이러스의 구조단백 분석을 위한 전기영동은 Laemmli(1970)의 방법에 따라 실시하였다. 즉 농축, 정제된 새우감염 바이러스를 동량의SDS-sample buffer(2.
성능/효과
- , 1995)(Fig 4). 그리고 새우 바이러스의 total DNA를 Bam HI로 digestion하여 확인한 결과 새우 바이러스의 핵산 크기는 약 114kb였다(Fig 5). 지금까지 보고된 자료에 의하면 일본서보리새우를 대량폐사시키는 새우류 급성 바이러스혈증(PAV)의 원인 바이러스인 PRDV의 핵산의 크기는 163kb 정도이고(Inouye et al.
- 따라서 본 실험에서 관찰한 결과에 의하면 새우바이러스는 감염된 세포의 핵내에서 증식함으로 인해 바이러스 핵산은 DNA인 것으로 생각되며,baculovirus와 본 바이러스를 비교하면 BP, MBV 및 PBV 바이러스는 감염세포중에서 다각체라 불리워지는 특이한 포매체(inclusion body)를 형성하지만 BMNV와 YBV 바이러스는 포매체를 형성하지 않는다. 따라서 포매체를 형성하지 않은 본 바이러스는 BMNV와 YBV 바이러스와 유사하지만 이들 바이러스와는 바이러스 입자크기에 차이가 있었다.
- 우리나라 새우양식장에서 분리된 새우 바이러스의 외막(envelop)이 있으면서 포매체 (inclusion txEdy)를 형성하지 않는 간상 바이러스로서, 바이러스 입자(viron)의 크기는ultrathin section 상에서 250~ 300X 50~70 nm였고,바이러스의 구조단백은 분자량이 14에서 190 kDa 범위내에 약 21개의 단백질 band로 구성되어 있으며, total DNA의 크기는 약 114 kb였다. 따라서 이상의 실험결과에 의하면 우리나라에서 분리된 바이러스는 WSBV로서 일본 보리새우양시장에서 분리된 새우류 급성 바이러스 혈증(PAV)의 원인 바이러스인 PRDV와 아주 유사한 바이러스로 생각된다.
- 않는다. 따라서 포매체를 형성하지 않은 본 바이러스는 BMNV와 YBV 바이러스와 유사하지만 이들 바이러스와는 바이러스 입자크기에 차이가 있었다.
- 새우 바이러스의 물리·화학적 특성을 알기 위해 바이러스액을 열, 강산, 강알카리 및 에테르 처리하여 새우 병원성시험을 통해서 시험한 결과, Table 2에서와 같이 에테르를 처리한 새우 바이러스는 병원성을 상실하여 시험기간동안 폐사가 전혀 일어나지 않았지만, 대조구에서는 100%로 나타났다. 石井(1973)에 의하면 일반적으로 외막을 갖는 바이러스는 지질 용해제인 에테르나 클로로포름등에 쉽게 실활되므로, 본바이러스 입자도 외막을 갖고 있다.
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